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请教各位:考马斯亮兰检测蛋白质中磷酸起什么作用?在配置考马斯亮兰时(称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml95%的乙醇后,再加入120ml85%的磷酸,用水稀释至1L)其中,乙醇和磷酸起什么作用?可不可以改变磷酸的浓度?
采用考马斯亮蓝法测定提取液中的蛋白质需要准备那些试剂及仪器?
一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。二、蛋白质含量测定方法 1. 凯氏定氮法2. 双缩脲法3. Folin-酚试剂法4. 紫外吸收法5. 考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 (一)试剂: 1. 考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇,加入100 ml 85% H3 PO4 ,雍蒸馏水稀释至1000 ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H3 PO4 。2. 标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15 mol/LNaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。(二)器材: 1. 722S型分光光度计使用及原理。2. 移液管使用。(三)标准曲线制作: 1. 试管编号0123456100ug/ml标准蛋白(ml)0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl (ml)10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂 (ml)5555555摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm2. 以A595nm 为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。(1)利用标准曲线查出回归方程。(2)用公式计算回归方程。(3)或用origin作图 ,测出回归线性方程。即A595nm =a×X( )+6;一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。(4)绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。(四)蛋白质含量的测定: 样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm ,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm 值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm 值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。(五)注意事项: 1. 玻璃仪器要洗涤干净。2. 取量要准确。3. 玻璃仪器要干燥,避免温度变化。4. 对照:用被测物质以外的物质作空白对照。蛋白质含量测定实验难度系数 0共 0 人点评打分实验材料结晶牛血清清蛋白 g—球蛋白试剂(盒)Na2CO3酒石酸钾钠蒸馏水硫酸铜钨酸钠钼酸钠磷酸硫酸锂液体溴NaOH酚酞仪器耗材可见光分光光度计旋涡混合器秒表[url=http://www.biomart.cn/equipm