美巴那肼

[align=center][b][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]分析技术用于美洛西林钠舒巴坦钠药物混合过程在线混合均匀度终点监测[/b][/align][align=left][b]摘要: [/b]利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]技术，对美洛西林钠、舒巴坦钠混合过程进行了在线监测。在研究中，分别建立了基于MBSD法的定性分析模型和基于舒巴坦钠百分含量的定量分析模型，通过3个平行实验的在线混合过程，结果显示MBSD法和舒巴坦钠百分含量测定法均能有效的监测其混合过程，有效的证明了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱分析技术用于舒巴坦钠、美洛西林钠混合在线监测的可行性。[/align][b]关键词[/b]：[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]；分析模型；混合均匀度；在线监测自从2004年美国食品与药品监督管理局提出“过程分析技术”以来，全球的药品生产企业正在向着更高技术含量的生产方式和质量控制方式进军。近红外（Near infrared，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]）光谱分析技术因其快速，无损的特点成为“过程分析技术”的重要组成部分，是制药企业进行产品中间体质量控制的重要方法之一。传统的检测方法为高效液相色谱法，紫外可见分光光度法等需要停止混合操作时才能取样检测，并且等待检测结果所需的时间也比较长，工作效率比较低，而[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱可以进行在线检测，连续记录不同混合时间内混合物的光谱图，建立数学模型对采集数据进行分析，从而判断各组分之间是否已经达到质量均一，工作效率大幅度的提高。本研究利用 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url] 光谱分析技术在线监测美洛西林钠舒巴坦钠的药物混合过程，从而实现混合终点的准确判断。[b]1 材料1.1试剂[/b]美洛西林钠（13102041，山东瑞阳制药有限公司）舒巴坦钠（SS201310-26，江西东风制药有限公司）[b]1.2仪器和软件[/b]AntarisII型傅里叶变换[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱仪[/color][/url]（美国ThermoFisher公司），附有积分球采样模块；RESULT采样软件；电子分析天平（Sartorius BT224S，德国）；TQ数据处理软件；表面皿；药匙；自制搅拌器。[b]2 方法2.1样品的准备[/b]精密称取舒巴坦钠固体原料药10.00g，美洛西林钠固体原料药40.00g，以备进行在线混合光谱的采集。平行制备3批样品，进行混合光谱的采集。[b]2.2模型的建立[/b]目前，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱分析技术用于混合过程在线监测的方法可分为活性药物成分（API）定量分析模型监测和基于移动块标准偏差（MBSD）的定性分析模型监测。前者为基于API药物含量的定量监测模型，当达到混合终点时，API的含量趋于一定值，可以依据模型监测的含量是否达到理论值并趋于稳定进行混合终点的监测；后者为基于光谱的标准偏差的定性监测模型。MBSD法的基本原理为：连续采集的若干张光谱间的标准偏差变化率趋于稳定并小于限定的一阈值时可认为达到了混合终点。其具体的计算步骤为：首先确定用于计算光谱标准偏差的光谱的条数n（即移动块的宽度），当[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱分析仪器采集到n张光谱后计算n张光谱的峰面积（或最大峰高、平均峰高等）的标准差，当采集到n+1张光谱时将第一张光谱移除，计算最近n张光谱的标准差，如此类推，最终得到随时间变化的光谱的标准偏差，根据标准差的变化进行混合终点的监测。本研究中建立了舒巴坦钠含量的定量分析模型和基于MBSD法的定性分析模型同时对用于混合终点的判断。[b]2.3在线混合光谱的采集[/b]将称取的美洛西林钠、舒巴坦钠原料药样品放入表面皿中，然后将表面皿放在Antaris II型傅里叶变换[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱仪[/color][/url]积分球采样模块的上面，采用积分球漫反射采样方式进行光谱的采集。在运行在线混合工作流的同时采用自制的搅拌器进行样品的混合，采集得到混合过程的原始光谱，同时监测混合过程。波长范围10000-4000cm[sup]-1[/sup]，每张光谱扫描次数4，混合过程中每间隔5s进行一张光谱的采集，光谱分辨率为8.0cm[sup]-1[/sup]，每4个小时进行背景光谱的采集。每张[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱由1557个变量点组成。[b]2.4定量定性分析模型用于终点判断数据分析[/b]将在线混合过程进行监测，得到在线混合过程数据进行分析，以便了解混合全过程信息以及混合过程的监测。[b]2.5混合终点分析[/b]当得到混合终点时分别采集混合后的样品6处的原始[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱，利用舒巴坦钠的定量分析模型预测混合终点时不同样品点处的舒巴坦钠的含量，判别是否混合均匀。[b]3 实验结果3.1分析模型的建立[/b]本研究中分别建立了在线混合过程的舒巴坦钠定量监测模型和基于移动块标准偏差的定性监测模型。[b]3.1.1 定性分析模型的建立[/b]目前混合均匀度在线监测常用的方法为MBSD法，本研究中MBSD法定性建模的参数为：选择的3个光谱区间包括全光谱、5275.6-4806.3cm[sup]-1[/sup]（称为Region1）及7096.76-6344.66cm[sup]-1[/sup]（称为Region2）；用于计算光谱偏差的光谱的条数为5（即移动块的宽度为5）。[b]3.1.2 定量分析模型的建立[/b]本研究中所建立的定量分析模型用于监测混合过程中舒巴坦钠的百分含量的变化，因为本实验中舒巴坦钠和美洛西林钠两者间的混合比为4:1，当达到混合终点时，舒巴坦钠的百分含量应该在20%左右。其模型的具体参数见上一章中得到的舒巴坦钠百分含量的定量分析模型。[b]3.2混合在线过程数据分析[/b]本研究中平行进行了3次混合过程的在线监测，分别对3次实验结果进行分析，以充分了解混合监测过程。[b]3.2.1 第一批实验结果分析3.2.1.1 原始光谱图[/b]图1给出了混合过程中采集得到的208张原始光谱，由图中可知，处于下面的光谱较稀疏，可能属于混合刚开始的阶段，光谱会有较大的差异；处于上面的光谱较密集，其原因为随着混合的不断进行，光谱间差异越来越小，所以光谱较集中。[align=center][img=,498,274]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141912_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图1 第一批混合过程原始光谱[/align][align=center] [/align][b]3.2.1.2 在线混合过程结果分析[/b]图2为定性分析模型中得到的3个光谱区间的峰面图，其中M1为全光谱建模的峰面积变化，M2为Region 1（5275.6-4806.3cm-1）的峰面积变化，M2为Region 2（7096.76-6344.66cm-1）的峰面积变化，由峰面积的变化图可知，混合过程的前100s其变化较为明显，M1不断升高，M2和M3（7096.76-6344.66cm-1）不断下降，之后峰面积值趋于稳定。[align=center][img=,525,234]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141913_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图2 光谱区间峰面积图[/align]图3为舒巴坦钠含量及标准偏差变化图，由图中显示在混合的初期阶段，尤其是前100s左右，四个表征混合均匀度的参数均有着较大的变化趋势，在200-300s间四个参数有稍微较小的波动，此后随着混合过程的不断进行，表征混合均匀度的四个参数变化范围均变小，模型给出的舒巴坦钠的百分含量在20%左右，舒巴坦钠和美洛西林钠混合较为均匀，达到了混合终点。由图可知前100s是混合的主要阶段，此阶段舒巴坦钠的百分含量和标准偏差均有着明显的变化。[align=center][img=,538,292]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141914_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图 3 含量和标准偏差变化图[/align][align=center]（a舒巴坦钠百分含量变化 b全光谱峰面积标准差 c Region1峰面积标准差 d Region2峰面积标准差）[/align][align=left] 当达到混合终点时分别采集表面皿下6个点的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱，根据建立的模型测定其舒巴坦钠的百分含量，看混合是否均匀。表2给出了用所建模型得到的6个点的舒巴坦钠的百分含量值，6个点舒巴坦钠的百分含量值在20%左右，说明混合较为均一，但是最大的值达到了22.41%，可能是由于混合装置过于简陋，加上是人为搅拌进行混合，不能达到很好的混合，部分地方没有进行很好的混合。从实验的可行性方面，初步证实了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]技术用于美洛西林钠舒巴坦钠混合的可行性。[/align][align=center]表1混合后不同点舒巴坦钠百分含量值[/align][align=center] [img=,570,70]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141915_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.2.2 第二批实验结果分析3.2.2.1 原始光谱图[/b]图4给出了第二批混合过程中采集得到的203张原始光谱，其混合过程原始光谱的特征和第一批混合过程较为相似，混合初期光谱变化较为明显，随着混合的进行，光谱差异变小，光谱较为密集。[align=center][img=,488,280]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141915_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图4 第二批混合过程原始光谱[/align][align=left] [b]3.2.2.2 在线混合过程结果分析[/b][/align]图5为各个光谱波段峰面积的变化图，由图中显示开始的100s内峰面积有着较大的变化幅度，随着混合的不断进行，峰面积的变化趋势不断减小并逐渐趋于稳定。[align=center][img=,516,307]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141916_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图5 光谱区间峰面积图[/align][align=center]（a 全光谱峰面积 bRegion 1峰面积 cRegion 2峰面积）[/align]图6为舒巴坦钠含量及标准偏差变化图，由图可知在混合的初期阶段大约0-100 s时，舒巴坦钠百分含量值及峰面积的标准偏差值有着明显的变化，全光谱峰面积的标准偏差（Full Range STD）在200-400 s间有较为明显的波段，此后随着混合过程的不断进行，四个参数变化范围均变小，模型给出的舒巴坦钠的百分含量在20%左右。由此可知前100 s是混合的主要阶段，此阶段舒巴坦钠的百分含量和标准偏差均有着明显的变化。[align=center][img=,551,327]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141917_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图6 含量和标准偏差变化图[/align][align=center]（a 舒巴坦钠百分含量 b 全光谱峰面积标准偏差 c Region 1峰面积标准偏差 d Region 2峰面积标准偏差）[/align]当达到混合终点时，采集表面皿底部6处的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱，检测混合过程是否达到均一，表2列出来了6处的舒巴坦钠的百分含量值，由表2可知达到混合结束后得到的6处的舒巴坦钠的百分含量均在20%左右，说明混合较为均匀。同时，由于实验条件的限制加上搅拌时人为因素的影响等，各点之间含量也着较大的差异。[align=center]表2 舒巴坦钠百分含量[/align][align=center] [img=,566,84]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141918_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.2.3 第三批实验结果分析3.2.3.1 原始光谱图[/b]图7给出了混合过程中采集得到的207张原始光谱，由图中可知，得到的原始光谱图与第一批和第二批有着相似的结果，即混合的初期光谱差异大，因此光谱较为稀疏（偏下方的光谱），随着混合的进行，光谱间差异变小，光谱变得密集（偏上方的光谱）。[align=center][img=,505,262]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141919_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图7 第三批混合过程原始光谱[/align][b]3.2.3.2 在线混合过程结果分析[/b]图8给出了混合过程中3个光谱区间峰面积的变化趋势值，由图中可知0-100s间三个光谱区间的峰面积有着明显的变化，100-200s间峰面积有着明显的变化，但是变化幅度没有前100s大，200s以后峰面积变化趋势变小。说明前200s是混合的主要阶段，峰面积变化较为明显。[align=center][img=,519,343]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141919_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图 8 光谱区间峰面积图[/align][align=center]（a 全光谱峰面积 bRegion 1峰面积 cRegion 2峰面积）[/align]图9为舒巴坦钠百分含量及光谱峰面积的标准偏差随时间变化的趋势图，其变化趋势和峰面积的变化趋势相似，前100s变化幅度较大，100-200s间也有较为明显的变化，但是变化幅度不是很明显，200s后舒巴坦钠的百分含量和峰面积的标准偏差均趋于稳定，说明此时光谱差异变小，混合趋于均匀。[align=center][img=,529,352]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141920_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图9 含量和标准偏差变化图[/align][align=center]（a舒巴坦钠百分含量变化 b全光谱峰面积标准差 c Region1峰面积标准差 d Region2峰面积标准差）[/align]表3为达到混合终点时采集表面皿底部的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱得到的不同点的舒巴坦钠的百分含量值，由表中显示6个点的舒巴坦钠的百分含量值在20%左右，但是6个点之间舒巴坦钠百分含量间存在较大的差异，测得的最小值为17.80%，其原因可能是一方面由于实验条件的限制混合不够均匀，一方面用于舒巴坦钠含量测定的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]定量分析模型也有一定的偏差，可能引起含量检测的差异存在。[align=center]表3 混合后不同点舒巴坦钠百分含量值[/align][align=center] [img=,564,66]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141921_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.3小结[/b]通过3个混合平行实验的进行可知所建立的基于MBSD法的定性分析模型和基于舒巴坦钠百分含量的定量分析模型能够有效的监测舒巴坦钠、美洛西林钠的混合过程。由舒巴坦钠百分含量和标准偏差变化图可知两者的变化有着相关性，当舒巴坦钠的百分含量变化幅度大时，其标准偏差的变化幅度也较大，因此两者均可以用于混合过程的在线监测，证实了实验的可行性。[b]4 结论和讨论[/b]本研究采用AntarisII傅里叶变换[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱仪[/color][/url]对美洛西林钠、舒巴坦钠混合过程进行了在线监测。在研究中，分别建立了基于MBSD法的定性分析模型和基于舒巴坦钠百分含量的定量分析模型，然后Antaris II傅里叶变换[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱仪[/color][/url]漫反射采样方式采集混合过程中的光谱，实时监测混合过程的进行。通过3个平行实验的在线混合过程，结果显示MBSD法和舒巴坦钠百分含量测定法均能有效的监测其混合过程，有效的证明了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱分析技术用于舒巴坦钠、美洛西林钠混合在线监测的可行性。此外，MBSD法因为无需进行一级数据的采集，方法较为简单且容易理解，目前常用于混合过程的在线监测。本研究中有效证实了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]光谱分析技术在舒巴坦钠美洛西林钠样品在线混合过程中应用的可行性，在样品的在线混合监测中有着重要的应用价值和应用前景。该技术能够克服传统方法费时、繁琐等缺点，而且可以实现过程的实时在线监测，让生产者充分了解整个生产过程中的参数变化。 [b]参考文献[/b]陆婉珍, 褚小立. [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url])和过程分析技术(PAT). 现代科学仪器, 2007(004):13-17.SieslerH, Ozaki Y, Kawata S, et al. Near-infrared spectroscopy: principles .Instruments, Applications, 2002:35-181.Bhushan,K.R.,et al.Detection of breastcancer microcalcifications using a dual-modality SPECT/[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url] fluorescent probe. J Am Chem Soc, 2008. 130(52):17648-17649.贾燕花. [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]分析技术在化学药品生产过程控制应用初探. 北京协和医学院, 2011.Fevotte.G,et al.Applications of [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]NIR[/color][/url]spectroscopy to monitoring and analyzing the solid state during industrialcrystallization processes . Int J Pharm, 2004, 273(1):159-169.张敏.盐酸林可霉素多晶型分子构象对其红外光谱行为的影响.中国抗生素杂志, 2005, 30(009):529-532.Blanco M,R Goz"01ez Ba,E.Bertran,Monitoring powder blending in pharmaceutical processes by use of nearinfrared spectroscopy . Talanta, 2002, 56(1):203-212,田科雄.不同装载系数和混合时间对添加剂预混料混合均匀度的影响.河北畜牧兽医, 2004, 20(9):52-53.孙栋. 基于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]分析技术的几种固体粉末混合均匀度快速检测研究. 山东大学硕士学位论文, 2012年.

【仪器故事】昙花一现的NASBA-ECL1背景以下内容摘自百度文库（链接地址：https://wenku.baidu.com/view/16614297daef5ef7ba0d3c93.html）NASBA（Nucleicacidsequence-basedamplification）技术是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术，这项技术特别适用于RNA分子的检测。其特点是整个扩增过程在恒温条件下进行，因此不需要特殊（如PCR仪）的控温装置，大大避免了PCR扩增过程中复杂的温度变化。借助NASBA技术平台，开发了世界上第一个成熟而广泛适用的禽流感早期快速诊断系统。此系统包括对禽流感各亚型包括高致病性病毒的特异性检测，为世界上多个国家地区用于禽流感的早期常规筛查和疫情防控，推动了国内外禽流感疫情监控的发展。该技术平台技术以NASBA病毒检测系统为中心，在确保高灵敏度、高准确率的前提下，使检测周期缩短至半天；且无需特殊的昂贵仪器，检测人员无需特殊技能；它是一个速度快、成本低并且实现了全自动检测的诊断系统，更重要的是此高效灵敏的设备适用于资源有限的高感染区，如：条件落后的基层偏远地区。这些地区也往往是疫情爆发的最前沿。该技术的应用显著减少了大面积筛查时的工作量和成本。由于该技术是恒温扩增，加上标准化的操作步骤，使不同实验室所得实验结果具有很高的可比性。NASBA技术平台的优越性包括：1.NASBA不会受到抗体存在的影响，能够区分接种疫苗的生物体中目的病毒存在与否。2.NASBA在禽流感检测中能够区分致病菌株和非致病菌株。3.对禽流感H5N1病毒的检测，已经充分的证明：NASBA的灵敏度可以与病毒检测“金标准”——病毒分离法相媲美。4.与NASBA相比，病毒培养方法操作繁琐、实验时间长，操作严格。即使熟练的技术人员至少需要14天的时间完成整个过程。5.使用NASBA技术，在最适实验条件下15小时能够扩增10[sup]12[/sup]倍，远远高于PCR的10[sup]9[/sup]倍的扩增效果。实验结果显示，NASBA技术比目前商品化的免疫检测试剂盒敏感至少1000倍，比常规PCR方法也敏感许多，与现行的病毒培养的检测方法灵敏度相当。但是病毒培养通常需要至少几天以上的时间才能得到结果，而NASBA技术常规仅需要4-6小时就可以准确地得到结果，便于尽早采取防治措施。英国与联合国兽医参考实验室(VeterinaryLabAgency)合作并验证，采用NASBA技术对来自不同地区、不同时期爆发的禽流感病毒进行检测，结果显示，NASBA-H5、NASBA-H7、NASBA-AIV均可准确无误地检出病毒。NASBA技术操作简便，自动化水平高，可以减少人为造成的误差。而且还是一种高通量方法，可以同时检测50个样本，非常适用于大规模样品的筛查，节省基层使用时的检测成本。NASBA技术的扩增产物为RNA分子，使用者可以根据需要选择不同的检测方法，如电化学发光法和酶联法等。而且，与PCR的产物DNA分子不同，RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染，避免了产物交叉污染实验仪器、操作环境导致的假阳性结果。适用于NASBA技术的样品范围很广，除动物组织，血液、体液样本外，还可对环境样本进行监测，如禽类饲养场所、交易场所、运输工具等等，因此为监测和控制禽流感的传播提供了有效的依据和手段。2动机2004年国内发生多起高致病性禽流感疫情，给国人的健康及畜牧业的发展带来了严重威胁，不仅家禽发生疫情，同时也有人感染病例。在此情况下，如何快速诊断禽流感疫情摆在面前，经过调研初步定下两套方案：第一套方案：传统的PCR扩增系统，采购全进口的PCR仪+电泳仪+凝胶成像系统，约需40万元，意向品牌为BIO-RAD，当时系统为较为流行的品牌的配置；如果增加核酸提取系统，约需增加30万元。第二套方案：新型的NASBA扩增系统，当时有些疾控中心采购了该系统，据说效果不错，整套系统68万元。两套方案各自其优缺点：PCR系统灵敏度较低，但试剂采购方面较为灵活，既可以采购商品化的试剂盒，也可以采购各单品种试剂自行配制混合液；同时可利用的检测标准很多，可委托生物工程公司合成引物后开展多个项目的检测，拓展性很好。NASBA系统灵敏度很高，据业务代表称可以将5~10份样品混合成1份检测，相对来说单个样品的检测成本更低。但只能采购商品化的试剂盒，拓展性不好，可利用的检测标准也只有禽流感一个系列。两套方案都有支持者，最后老大拍板决定还是购买更先进的NASBA。3蜜月2005年设备终于采购到位，到了好几大箱的东西，除了ECL化学发光阅读器外，还有干燥箱、水浴锅、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]和几个试剂盒。安装时问了工程师才知道，原来干燥箱、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]都是用于核酸提取的，水浴锅是用于扩增的，ECL化学发光阅读器是用于检测的。操作流程简述如下：3.1核酸提取3.1.1原理：样品中加入裂解液使RNA游离，加入硅土进行吸附，然后洗去杂质，最后加入洗脱液将硅土中的RNA洗下。3.1.2实际操作：裂解：向0.1mL样品（如拭子上清液）中加入0.9mL裂解液混匀；吸附：加入0.05mL硅土悬浮液混匀，室温孵育10 min，以12000r/min离心30 s，移去上清；洗涤：加入1 mL洗涤液混匀，以12000 r/min离心30 s，移去上清；加入1 mL70%乙醇混匀，以12000r/min离心30 s，移去上清；加入1mL70%乙醇混匀，以12000 r/min离心30 s，移去上清；加入1 mL无水乙醇混匀，以12000 r/min离心30 s，移去上清；干燥：将离心管敞口置于干燥箱内，56℃干燥10min；洗脱：每管加入0.05 mL洗脱液并混匀，56℃孵育10min；以12000 r/min离心2 min，将上清转移入另一支离心管，即为所提取的核酸。3.2核酸扩增3.2.1原理：NASBA体系中含有T7RNA聚合酶、RNaseH、AMV逆转录酶、NTP、dNTP、引物（P1和P2）以及反应缓冲液。NASBA整个反应分为两相：非循环相和循环箱。在非循环相，引物P1与模板RNA退火，AMV逆转录酶催化合成一条cDNA链，形成RNA-DNA杂交分子，RNaseH水解杂交分子上的RNA，留下一条单链DNA。引物P2随后与这条DNA链的5’末端退火，AMV逆转录酶催化合成第二条DNA链。T7RNA聚合酶识别双链DNA中的启动子区，催化DNA转录为RNA，由每一分子可产生100拷贝RNA。新合成的RNA进入循环相，成为反转录的模板。它们首先与引物P2结合，由AMV逆转录酶催化合成一条DNA链，形成RNA-DNA杂交分子，RNaseH水解RNA，留下一条单链DNA，引物P1退火，逆转录酶再催化合成一条新的含有T7RNA聚合酶启动子的DNA片段，T7RNA聚合酶再以此DNA为模板成更多拷贝的RNA，如此循环反复，RNA拷贝数被不断放大。3.2.2实际操作：向试管中加入5μL核酸、10μL扩增试剂，于65℃孵育5min；取出于41℃孵育5min；然后加入5μL酶溶液并混合均匀，继续于41℃孵育5min；取出试管稍作离心，继续于41℃孵育90min。3.3检测及判定3.3.1原理：扩增产物可利用ECL化学发光技术进行检测。扩增反应完成后，用生物素标记的捕获探针和5’标记有电化学发光剂（TAG）的ECL检测探针与RNA产物共同作用形成复合物，被寡核苷酸饱和的磁珠携带到电极处，低电压作用下钌离子的氧化还原反应可产生光子。然后在TPA作用下，钌离子再生。因为在此过程中产生光信号的强度与吸附于电极的RNA产物正相关，所以用电化学反光检测仪测定620nm处的发光强度可对RNA定量。3.3.2实际操作：取（N+2）个5mL聚丙烯试管进行编号，其中1号作参照，2号作试剂空白；除1号管外，各加入杂交溶液20μL；2号管加入检测稀释液5μL，其余管各加入扩增产物5μL，封口膜封管，振荡混合；所有试管于41℃孵育30min；除1号管外，其余试管各加入分析缓冲液0.3mL；振荡仪器调试参照液至不透明，然后加IRS 0.25mL至1号管；将所有试管放入进样器，建立程序开始检测；判定：测定值/仪器参照液读数≥0.15，判定为阳性；否则判定为阴性。3.4体会对于初涉分子生物学的菜鸟，NASBA技术确实比较方便，一是扩增不需要昂贵的设备，只需要2个水浴锅即可；二是检测实现了自动化，只需将反应体系配制完成后，放进进样器，建立程序即可自动检测；三是扩增效率确实比较高，我们曾经在10份样品制成的混样中检出阳性样品，后来对这10份样品进行逐一检测，其中也只有1份样品是阳性的。4龃龉使用了一段时间后，也发现了NASBA存在一些问题，诸如：4.1对环境温度要求非常严格。仪器说明书上写明使用温度为15℃~25℃，一开始以为是推荐值，后来发现这玩意儿在玩真的，室温一旦超过临界值，仪器就报警且停止工作，除非将室温调整到该范围内。从此以后，只要在夏天或冬天开展NASBA检测，我们就必须至少提前数小时将检测室空调打开，否则根本玩不转。4.2检测速度慢。经测试，NASBA检测一个样品需1.5min，对于检测几个样品来说影响不大，但在大规模筛查时就不一样了。我们有一次检测300份样品，以5:1混样，实际检测60份混样，为了判定参照液是否稳定，特地在最后一份样品后安排了一次测试，结果发现测试值居然只有最开始的60%左右。向厂方提出疑义，答复是NASBA的灵敏度非常高，一般的样品要么测试值非常低（阴性样品），要么测试值非常高（阳性样品），参照液测试值下降不影响最终结果的判定。尽管实际检测也未发现有临界值样品，但心中总是留下一个疙瘩。4.3软件界面简陋。仪器是2005年购入的，当时Windows XP已发布4年，而随机软件居然还是DOS版本，操作相当不便。4.4扩展性不强。当时配套的试剂仅有禽流感、蓝耳病等几个病种，远不如PCR试剂丰富，而且检测标准也只有GB/T 19439-2004《H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法》及GB/T19440-2004《禽流感病毒NASBA检测方法》，实验室想在NASBA检测项目上通过认证非常困难。5分手2007年国内蓝耳病疫情频发，为了摸清本地疫情情况，准备开展一次大规模检测，采样数量500份左右，需要2个检测试剂盒。向区域代理下了订单后，久久等不到试剂，反复沟通打了不下几十个电话才搞清楚，原来NASBA试剂的订购流程如下：客户向区域代理下单——区域代理每周一次向国内总代下单——国内总代向香港工厂下单——香港工厂接单后安排生产——香港工厂进行质量检测合格后将试剂发给客户。一开始我对这个流程还是有些不相信的，不过等了将近两个月接到HK Express的快递后，我才不得不相信这些试剂真是香港直接寄过来的！众所周知，疫情来了那就如消防队员扑灭火灾一样，实验室必须在接到样品后的第一时间开展检测，但大陆居然没有NASBA试剂的现货，一盒都没有，我求爷爷求奶奶让他们提供一盒应急，居然也没有！他们都是在接到客户订单后，然后通知工厂按订单生产的，前后耗时近两个月！如果真的发生疫情，这台仪器又能起什么作用！基于NASBA试剂的供应流程之慢，我们只能将这台只用了两年，耗资68万元的NASBA系统束之高阁，另外建立PCR平台开展实验，这也是我从事实验室工作近20年遇到的设备采购中最遗憾的一件事。最后的几句话：写下此文，我的心情是比较低沉的，初衷并不是想贬低设备，出自国际大品牌的设备自有其优越性，但由于试剂供应的问题，目前在我们行业几乎均是束之高阁，很令人遗憾。希望厂家能改进试剂生产供应流程，增加品种，焕发昔日荣光。最后附上一张该设备的照片，纪念那逝去的十年光阴。[img=,690,920]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810241140300373_5908_1627156_3.jpg!w690x920.jpg[/img]