奎尼卡因

仪器信息网特别策划话题：#3i流式大咖说#（点击查看） ，邀请高校、科研院所、临床、生物技术企业等流式技术研发、应用专家分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解相关技术应用进展、学习仪器使用方法。本期，中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司的谢简明老师、亢中奎老师带我们了解全光谱流式的那些事儿 。全光谱流式十问十答作者：谢简明、亢中奎 单位：中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司 作为大陆第一台第一批全光谱流式使用人员，和大家分享一些其他用户经常问到的问题。本着互相学习交流，共同进步，先知觉后知，先觉觉后觉，如有不妥或者谬误，请各位指教。Q1. 为什么称“她”为全光谱流式？答：全光谱流式是相对传统流式而言，传统流式只检测发射光谱中特定波长的荧光，全光流式检测发射荧光的所有波长。传统是检测最高峰段荧光，全光谱流式是检测整个荧光发射谱图。Q2.全光谱流式需要补偿么？答：全光谱流式一般不需要调补偿，“她”是通过解析算法，分开各荧光。只有当解析出现瑕疵，为追求完美，才会用手动进行补偿微调。Q3.什么是全光谱流式解析？答：从Raw文件到Unmixed文件，就叫做解析。当发射荧光重叠混合在一起（MIX），把特定荧光的量区分开来就叫解析。在特定激发光条件下，荧光素有其特定荧光谱图，整体荧光可看做各荧光谱图的混合，把混合荧光的逐一分开就叫解析。好比一团不同颜色的线团，抽出特定颜色的线条。Q4.全光谱流式仪器参数与单染设置？答：全光谱流式一般不需要调电压，根据每日质控会给出一个最优电压组合；其余参数如FSC、SSC、阈值、流速、圈门、获取数等可根据需要自行设置。整体荧光的解析是根据各个荧光的特征谱图拆解而来，因此想要准确解析，单染就必须准确代表。一般单染设置和样本同等操作条件，即同试剂、同浓度、同操作、同设置、同时间。若低表达或连续表达可以选用补偿微球替代细胞作为单染，单染抗体浓度可大于样本用量。不必每次实验都做单染，但为了准确解析，需要使单染和检测样本状态尽可能一致。Q5.如何查看解析是否正确？答：可查看解析后的单染，解析准确时只有单染荧光有阳性，且单染标记横平无喇叭状；或在样本中看N×N图，是否全部横平竖直。简单panel一般不会出现问题，多色配色N×N图难免出现个别偏斜，若问题不是很严重，可忽略或手动调补偿。样本最后检测结果两两组合即所有N×N图都横平竖直是流式数据优秀的黄金标准，一句话“黑猫白猫，抓住老鼠就是好猫，横平竖直就是好的”。Q6.什么是异质性自发荧光？答：质胜文则野，“质”的本意就是朴素无修饰的意思，理论上单染中的空白对照（Unstained）应该是无荧光（这时叫做质）。实际上却往往出现荧光信号，已经不同于“空白”，所有称异质性自发荧光。自发荧光可归于NADH、叶酸、视黄醇、核黄素等生物大分子受激光激发而产生荧光。为准确解析，应该把他们去除掉或者作为单染荧光参与解析。Q7.全光谱流式如何配色？应该明白，流式虽没有完美配色，但依旧有其规则。强抗原搭配弱荧光，共表达抗原搭配荧光差异最大化（CD3、CD4共表达，CD3-FITC与CD4-BB515组合就不如CD3-FITC与CD4-APC组合。因为FITC和BB515近与APC远，且FITC与BB515为蓝光激发，APC为红光激发。荧光横竖都比较远，横代表最高峰所在检测通道，竖代表所需激发光）。有时按下葫芦起了瓢，有合适荧光素没抗体，有抗体时荧光素已经用了，需要综合考虑，做好风险平衡。Q8.全光谱流式最多测多少个荧光？以三激光38通道为例，目前官方公布实测Panel多达24色，本人测过20色Panel，理论上Panel可含更多荧光（38-2）。在实际应用中，目前主要受制于荧光素及抗体试剂的开发。Q9.最高峰在同一通道的荧光可以测么？可能可以，全光谱流式是通过荧光谱图的差异来区别开，而非简单最高峰。但如果整个荧光谱图极其相似，相似指数大于0.98，则不能区分开来。好比双胞胎太像了，亲妈都分不开。Q10.全光谱流式数据怎么处理？全光谱流式数据和传统流式，依旧是FCS形式文件，只不过有含有两个文件，一个是未解析的Raw文件，另一个是解析后的Unmixed文件，一般选择Unmixed文件分析就好。当流式文件数据量大（几十G），参数维度多（20+）时，可能需要一些技巧。流式数据看到的细胞是虚拟化的点，每个点包含不同维度的信息，一个个点构成了流式数据，因此数据可拆可合，可升维亦可降维。给出以下建议供大家参考：拆开处理：如拆开成单一细胞群体FCS文件，如：NK、CD8+、CD4+单独分析；数据剔除：把记录的碎片、死细胞（计算活率时除外）去除掉，生成新的FCS文件；删除参数：一些参数是机器自带（如时间、体积），可以删除，从而减少文件大小；降维处理：为方便查看结果，降维之后可在二维平面上查看（推荐用T-SNE）。_____________________________________参考文献：1、 Ferrer-Font, L., Pellefigues, C., Mayer, J. U., Small, S. J., Jaimes,M. C., & Price, K. M. (2020). Panel design and optimization for high-dimensional immunophenotyping assays using spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry, 92, e70.doi: 10.1002/cpcy.702、 Ferrer-Font, L., Small, S. J., Lewer, B., Pilkington, K. R., Johnston, L. K., Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C., & Price, K. M. (2021). Panel optimization for high-dimensional immunophenotyping assays using full-spectrum flow cytometry. Current Protocols, 1, e222. doi: 10.1002/cpz1.2223、 Farrand K, Holz L E, Ferrer‐Font L, et al. Using Full‐Spectrum Flow Cytometry to Phenotype Memory T and NKT Cell Subsets with Optimized Tissue‐Specific Preparation Protocols[J]. Current Protocols, 2022, 2(7): e482.【作者简介】中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司流式专员 谢简明谢简明，中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司流式专员。组织参与多个流式实验设计及实验操作、临床流式样本数据收集、免疫检测流式数据整理分析，擅长流式高维数据的降维分析。2020年受仪器信息网邀请，作“基于全光谱流式高维数据的降维聚类分析”报告，受到广泛好评（B站浏览量3000多人次）。自2018年公司购入大陆第一台Cytek Aurora，公司流式平台已发表多篇论文。中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司流式仪器平台负责人 亢中奎亢中奎，中科蓝华（广州）生物医药技术有限公司流式仪器平台负责人，有多年的流式细胞术实践经验，对大型全光谱流式多色实验实验设计和实施有比较丰富的经验，对Flowjo软件对高维流式数据进行tSNE降维分析、FlowSOM、Phenograph自动分群算法有比较深入的理解，善于发现未知细胞群体。因采购调研，对各主流厂家的流式细胞分析仪均有所了解。（本文编辑：刘立东 KOL ） 相关推荐：流式大咖说|量化成像分析流式在水生生物研究中应用——中国科学院水生生物研究所高级工程师 汪艳流式大咖说|FSC与SSC在流式细胞术中的应用——西南医院马清华副研究员流式大咖说|流式检测中最易忽视的时间参数——首都医科大学中心实验室副主任技师 徐晓雪  流式大咖说|技术干货|如何去黏连？流式新手绕不开的数据处理难题  流式大咖说|流式细胞技术平台发展与使用心得分享中科院分子细胞卓越中心 俞珺璟博士 流式大咖说|流式、免疫组化、免疫荧光的抗体区别 流式大咖说|流式荧光技术检测与化学发光技术检测那些事儿【行业征稿】若您有生命科学、医药、临床等行业相关研究、技术、应用、管理经验等愿意以约稿形式共享，欢迎自荐或引荐投稿联系人：刘编辑word图文投稿邮箱：liuld @instrument.com.cn微信：JaysonXY（备注来意：投稿）

IKA--人气之王,光彩亮相“2010慕尼黑分析生化展” 2010年9月15日，慕尼黑上海分析生化展盛大开幕，IKA 也趁今年100岁之际，光彩亮相该展会， 面向所有用户，代理商，媒体举办了一次公开庆典。 慕尼黑上海分析生化展，为观众带来最新科学仪器、尖端分析测试技术，提供全方位的实验室解决方案，据报道，有来自22个国家和地区的468家领先企业齐聚亮相上海新国际博览中心，同期举办的各类高质量研讨会、展商技术交流会呈上100多场精彩报告，数千名专业观众在此进行交流和学习，可谓盛况空前。慕尼黑分析生化展自8月伊始便在广州，上海等地陆续举行了新闻发布会，并与当地重要展商一道，进行了系列热身活动：在广州特邀德国IKA公司出席了媒体见面会。 位于W2号馆德国展团内的IKA，以一贯IKA标志性蓝色呈现在展区黄金地段，除了展示经典产品亮相外，最新的德国产品与技术也亮相会场： 1） 获得IF 工业设计大奖的新型RV10控制型旋转蒸发仪及“三合一”套装； 2） 最近整合面世的中试产品系列，实现从小型实验室到生产车间的完美过渡； 3） 振荡摇床系列： KS4000恒温摇床， 及刚刚推出的旋涡混匀器：V1，V4 基本型与数显型； 4） 试推出的小型分散机：新型T10小型分散机与UTTD试管分散机。 新型T10调速旋钮采用竖式旋钮， 更加适合手持操作；转速达30000RPM。新型UTTD试管分散机控制型，集分散，混匀搅拌，研磨功能三合一，采用封闭式样品管，适用于易感染，有毒以及气味浓的样品处理，最高转速可达8000RPM， 并可设置间歇性的左右旋转。 布置一新的IKA展台 据不完全统计，自9月15日至17日上午，IKA展台访问人数逾3000人次，其中登记客户人数达1000人。连展会主办方新闻中心摄影记者也是常常流连于IKA展位，用摄影师的话说这里堪称人气之王！说道IKA展位的人气，不得不提IKA在本届展会的亮点之一 – “幸运大转盘”大抽奖了！这个活动用到展会上来可以说颇有新意，专门订制了一套转盘摇奖仪，而奖品亦丰富诱人，一等奖是IKA公司总经理亲自挑选的来自IKA总部巴顿地区出产的德国红酒，而这种红酒在国内罕有销售，实为珍品。据IKA公司市场部的记录，来自上海医学院的一位女同学和一位来自韩国的用户幸运地抽到了这个奖品！ 而其它获得二等奖（IKA特制U盘）和三等奖（高级真皮笔记本）的观众就更多了，基本上展会期间每个正点，都有访客前往排队摇奖；值得一提的是四等奖和五等奖，即IKA百年礼券之折扣券和免费维护券，这是IKA百年纪念对广大用户的回馈，也得到了不少用户的青睐，展会刚结束不久，就有用户打来电话咨询折扣券的使用事宜。 IKA最新推出的混匀器系列 IKA展位“幸运大转盘”摇奖现场 为庆祝百岁华诞， 回馈客户， IKA中国公司在展会现场另外安排了专题报告。9月15日下午15：30，IKA中国公司产品经理黄山先生在展商技术交流区作了题为“混合分散对提高药品稳定性的应用”的专题报告，该报告切合当今医药领域应用难点（如：如何让药品保持原有的物性，如何确保药物中因体成份的均匀悬浮，如何有效降低药物的加工时间），解析新药典中注意事项，融合并详解IKA混合分散乳化产品的独到之处，演讲十分精彩，现场吸引了众多专业观众。 IKA 中国公司产品经理黄山先生专题报告现场 而IKA堪称人气之王的最大一个亮点莫过于在展商技术交流区举办的 “IKA 100周年德国啤酒派对”了！IKA自1910年创立，到2010年， IKA 100岁了！IKA作为实验室前处理/量热分析/混合分散工业技术的领导品牌，暨2010年百岁生日之际，能以这样的一种形式光彩亮相于慕尼黑分析生化展，实在是相宜之合，当天派对时间，几乎所有在展馆的客户群集于此，但因场地限制，仅允许有150人左右进入派对区域，近距离欣赏外耤乐队的精彩演出和品赏德国啤酒美食，而现场进行的五个幸运抽奖，分别由来自IKA德国总部的集团销售总监Georg Kiefer先生，高级市场经理Harald Moessinger先生，集团产品经理Kai Linde 先生以及IKA中国总经理Klaus Jacuk先生抽取，将派对气氛推至高潮，共有五位客户获得IKA送出的世博门票和德国珍品红酒，他们是： 雷伯特（上海）实验室设备有限公司 易小姐 上海能效中心 吴工程师 上海人和科学仪器有限公司 徐伟经理 上海大联石油化工有限公司 郑工程师 Deepak Novochem Technologies Ltd Mr. Mahesh S. Kokje 派对现场一 派对现场二 派对现场乐队表演 派对现场三 对于派对活动的成功举办，IKA公司市场总监李波女士在接受媒体采访时说，非常感谢大会主办方的支持和信任，感谢来自德国MMI公司副总裁Susanne Groedl女士拔冗前往派对现场致辞，也要感谢一路风雨同行的代理商代表上海人和公司总经理李永先生的发言，感谢所有在现场和不在现场的IKA忠实客户，IKA 时值百年，用心举办此次亮相，以回馈广大客户，相信客户的到访定然会行有所值，祝愿所有的朋友都有一个“快乐的IKA时光”。 IKA中国公司总经理Mr. Klaus Jacuk致辞 展会主办方MMI公司展会总监Susanne Groedl女士致贺辞 IKA代理商代表上海人和科学仪器有限公司总经理李永先生致贺辞 IKA中国公司总经理Mr. Klaus Jacuk与市场总监李波女士在派对现场 关于 IKA® ( www.ika.net , www.ikaasia.com ) IKA 集团是实验室前处理, 量热分析, 混合分散工业技术的市场领导者. 磁力搅拌器, 顶置式搅拌器, 分散均质机, 混匀器, 恒温摇床, 研磨机, 旋转蒸发仪, 加热板, 量热仪, 实验室反应釜等相关产品构成了IKA实验室分析的产品线, 而工业技术主要包括用于规模生产的混合设备, 分散乳化设备, 捏合设备, 以及从中试到扩大生产的整套解决方案. 集团总部位于德国南部的Staufen, 在美国,中国, 印度, 马来西亚, 日本, 巴西等国家都设有分公司.

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