色谱洗脱方法

HPLC和HPLC-MS是现代化学和生物医学研究领域的中强有力的分析手段，同时也是广泛使用的一类分析仪器。目前，这类仪器的使用局限于正式的实验室环境，一部分是由其成本和复杂性所致，同时也受限于该类仪器所消耗的溶剂及其产生的废液的特殊处理要求。该类仪器不断创新，在成本、尺寸和复杂性方面都有所减少(小)，HPLC和HPLC-MS也许不久就会打破传统实验室的限制，成为可移动和普遍使用的分析仪器。然而，该类仪器对传统有机溶剂的依赖限制了其可移动性。 　　在进行HPLC实验中，化学家们最常使用乙腈来进行混合物的分离。2009年，世界范围内乙腈短缺，导致其价格暴涨。研究人员发现，乙醇是一个很好的替代品。不过，HPLC级别的纯乙醇的成本很高，通常约120美元/升。 　　最近，HPLC方面的创新，减少了仪器的尺寸和成本，也许有一天，HPLC可以在医生的办公室里使用。所以Erik L. Regalado, Christopher J. Welch，以及Merck研究实验室的同事们希望寻找更便宜的，和HPLC级别乙醇性能一样的溶剂。 　　研究人员利用从当地酒类专卖店购买的白酒和从超市里买的氨水和白醋作为洗脱液，在传统的HPLC仪器上实现了混合物：尿嘧啶、咖啡因、1-苯基乙醇、尼泊金丁酯、蒽的分离。 　　对于HPLC来说，化合物的分析取决于物质在色谱柱中的移动速度，该研究团队发现，谷物酒精，22美元/升，是HPLC级别乙醇的一个很好的替代品，尤其是分析那些色谱柱中移动缓慢的亲水性化合物时。朗姆酒和低浓度的白酒在洗脱强保留成分时效率不好，但是它们可以在更短的时间里干净地分离从色谱柱上流出的成分。在HPLC/MS仪器上分析红茶中的咖啡因和茶氨酸，以及柑橘和补充片剂中的维生素C时，基于从商店购买的白酒的洗脱液表现了与HPLC级别乙醇一样的性能。 　　在微流控HPLC仪器上的类似分析所需溶剂量更少。通过香草提取物中香草醛的高通量分析实验发现，航空服务中提供的一杯伏特加足够1560次的测量。 　　&ldquo 实际上,白酒是一个获得乙醇的更方便、更经济的方式&rdquo ， Welch说。他们测试的这些酒中，朗姆酒、伏特加、巴西朗姆酒和烧酒酒精含量最多40%，而谷物白酒中酒精含量为95%。 　　研究人员承认，采用乙腈(售价50美元到130美元/升)，这些分析可能更快，结果分辨率可能更高。&ldquo 然而，这种方法在绿色化学和成本方面的优势为传统实验室外的HPLC/MS仪器的使用展示了引人关注的可能性，&rdquo Welch说。 　　Amgen的首席科学家和非赢利绿色化学组织的主席Larry Miller认为无毒害物质可以进行色谱分离,在许多情况下,大致相当于使用乙腈。&ldquo 当然，这其中仍有很多挑战,包括价格和小仪器的实用性，这些都是必须克服的，然后才可以实现HPLC/MS在非传统环境中的常规使用。&rdquo Miller说。 　　相关文章：Cocktail Chromatography: Enabling the Migration of HPLC to Nonlaboratory Environments. ACS Sustainable Chem. Eng. 2015.

在SPE固相萃取产品中，洗脱液对整个过柱过程至关重要。月旭科技针对不同类型的柱子给出不同洗脱液的选择，为客户能够更好的选择合适的产品。在考察洗脱溶剂的选择可以从溶剂的极性指数、溶剂的选择以及洗脱强度入手。溶剂的极性指数越大，对极性化合物的溶剂能力越强。反相固相萃取柱洗脱液的选择在反相固相萃取中，一般选择目标化合物溶解度高的有机溶解剂作为洗脱溶液。根据目标化合物的机构及官能团，依据相似相溶原理，可以选择极性相似的洗脱溶剂。对于强极性的SPE柱，在洗脱时应选非极性强的溶剂。对于弱非极性SPE柱，在洗脱时应选非极性弱的溶剂。离子相固相萃取柱洗脱液的选择对于阴离子交换柱：满足下面一个条件都能将阴离子化合物从阴离子交换柱上洗脱下来。1.洗脱溶剂的PH高于吸附剂阴离子交换官能团的PKa两个单位；2.洗脱溶剂的PH低于目标物PKa两个单位；3.洗脱溶剂为高阴离子强度的缓冲液；4.洗脱液为高选择性的阴离子。对于阳离子交换柱：1.洗脱溶剂的PH低于吸附剂阴离子交换官能团的PKa（PH=PKa+lg[A-]/[HA]PKa越小，酸性越强，反之PKa越大，酸性越小）两个单位；2.洗脱溶剂的PH高于目标物PKa两个单位；3.洗脱溶剂为高阳离子强度的缓冲液；4.洗脱液为高选择性的阳离子。正相固相萃取柱洗脱液的选择在正相固相萃取柱中，洗脱剂的选择可以根据溶剂的洗脱强度来考虑。正相硅胶柱：甲醇、四氢呋喃、异丙醇、乙腈、异丙醇等。

Michael D. Jones、Andrew Aubin、Paula Hong和Warren Potts 沃特世公司（美国马萨诸塞州米尔福德市） 应用优势 1.正交法进行药物杂质分析 2.用于药物杂质分析的 UPC2 方法 3.对杂质采用超临界流体色谱分析符合 ICH 指南和法规要求 沃特世解决方案 ACQUITY UPC2&trade 系统 ACQUITY UPC2色谱柱套装 Empower® 3软件 ACQUITY® SQD质谱仪 关键词 UPC2，药物杂质，稳定性指示方法，降解分析，方法开发，甲氧氯普胺，合相色谱 简介 超高效合相色谱 (UPC2&trade )以亚2 µ m颗粒为固定相，采用超临界流体二氧化碳作为主要流动相成分。合相色谱是一种使用少量溶剂即可实现高速分析的分析工具，尤其是在分析杂质时，相比于反向液相色谱(LC)，合相色谱的正交方法更有利于发现未知杂质。合相色谱的方法开发不同于液相和气相色谱的方法开发策略，后者已经基本成熟。为了简化这个过程，我们需要研究一种系统的方法，用于开发非手性物质的合相色谱方法。 了解药品和药物材料中的杂质分布是一个重要步骤，样品纯度的评估可帮助制药公司在药物开发过程中做出决策，推进药物上市进程。杂质分布将确定供应商所提供原材料的质量、成品的保质期、合成途径和防止伪造的知识产权保护。色谱图的正交对比有助于生产商作出最明智的决策。在本应用纪要中，实验采用ACQUITY UPC2系统分析甲氧氯普胺及其相关杂质。如图1所示，甲氧氯普胺（胃复安）是一种止吐药，可以治疗胃灼热、胃溃疡以及由化疗导致的恶心。方法开发研究了色谱柱和溶剂，以确定优化特异性和峰形的合适方法条件。 图1. 甲氧氯普胺的化学结构。 实验 UPC2条件 系统：配备PDA和SQD检测器的ACQUITY UPC2系统 色谱柱：ACQUITY UPC2 BEH 2-EP 3.0 × 100 mm，1.7 µ m 流动相A：CO2 流动相B：含1 g/L甲酸铵的甲醇/乙腈(50:50)溶液，加2%的甲酸 清洗溶剂： 70:30的甲醇/异丙醇 分离模式：梯度；溶剂B在5.0 min内由2%增加至30%；达到30%后，保持1 min 流速：2.0 mL/min CCM 反压：1500 psi 柱温：50 ℃ 样品温度：10 ℃ 进样体积： 1.0 µ L 运行时间： 6.0 min 检测条件： PDA 3D通道：PDA，200到410 nm；20Hz PDA 2D通道：270 nm，4.8 nm分辨率（补偿500到600 nm）SQD MS：150到1200 Da；ESi+和ESi- 补液流速：不需要 数据管理： Empower 3软件 样品描述 分离度溶液由甲氧氯普胺和八种相关杂质制备而成，将其置于TruView&trade 最大回收样品瓶中等待进样，如表1所示。杂质的浓度为甲氧氯普胺标准品浓度的0.1% w/w。分离度溶液用于色谱分析方法开发。 表1. 甲氧氯普胺杂质标准品、峰的名称、质量数和欧洲药典分类列表。 结果与讨论 系统筛选 方法开发过程对色谱柱、改性剂和改性添加剂进行了系统筛选，以获得最佳分离结果。初始的配置通过四种改性剂对四种UPC2色谱柱进行了筛选。&ldquo 改性剂&rdquo 是强溶剂流动相，有利于洗脱极性较强的分析物。所使用的四种溶剂分别是甲醇、含0.5%甲酸的甲醇、含2 g/L甲酸铵的甲醇和含0.5%三乙胺的甲醇。筛选过程采用溶剂B在5 min内从5%增加至30%，达到30%时保持1 min的常用梯度。总筛选时间仅两个多小时。对比各色谱柱所得峰可以发现，含有甲酸铵的甲醇总体上可提供最好的峰形，如图2所示。方法筛选过程中通过查看ACQUITY SQD提供的质谱图实现峰跟踪。对于极性较强的分析物，选择性(&alpha )有很大不同。在这些对比实验中，流动相保持恒定，因而不断变化的&alpha 是由[固定相 &ndash 溶质]相互作用所导致。 图2. 色谱柱筛选结果。改性剂(B)是含有2 g/L甲酸铵的甲醇。溶剂B在5 min内从5%增加至30%，达到30%时保持1 min。 基于这些结果，UPC2 2-EP固定相是最佳的色谱柱选择，可以为大多数分析物提供更好的峰形和分离度。UPC2 CSH Flouro-Phenyl色谱柱可以提供较好的选择性和峰形；但是，杂质C未能按预期分离成两个峰。这种未知现象将在未包括在本应用纪要中的另一组实验中进一步考察。1 梯度斜率的影响 在反相LC中，梯度斜率是控制选择性和分离度的常用工具。使用UPC2 2-EP固定相，延长总的梯度运行时间可以降低梯度斜率。斜率的改变对色谱图基本没有影响，仅使峰6和7之间的选择性发生改变，如图3所示。 图3. 归一化的x轴叠加显示甲氧氯普胺，采用延长的12 min和35 min梯度运行时间，其斜率较6 min的筛选实验更小。使用原始梯度；溶剂B由5%增加至30%。 不同洗脱溶剂的影响 使用变化率较平缓的梯度并未增加峰与峰之间的分离度。为提高分离度，将低极性非质子有机溶剂（乙腈）与甲醇（极性较强的洗脱溶剂）以不同比例混合。乙腈的添加提高了分离度，扩展了峰之间的分离间隔。这些现象证明本方法可在方法开发中发挥重要作用，如之前发表的结果所示。1 图4. 如叠加图中突出部分所示，在改性剂成分中添加乙腈后，后部洗脱分析物的分离度明显提高。 在添加剂筛选过程中，我们也考察了每种杂质各自的标准品。甲酸可以优化杂质H的峰形；但是，它会影响其它相关物质的色谱分析性能。添加剂的浓度也会对峰形产生影响。为了得到更理想的峰形，浓度需要高于反向LC的常用浓度。增加甲酸的浓度可以进一步改善杂质H的峰形，如图5所示。但是，杂质F的峰形受到了影响，如图6所示。组合使用甲酸和甲酸铵可同时获得两种添加剂的优势，使全部的分离均获得最佳峰形。在改性剂中使用添加剂甲酸和/或甲酸铵对过期样品进行分析所得结果如图7所示。在此对比实验中使用过期样品使我们能够更好地评估已知杂质在存在未知杂质条件下的选择性和峰形。如图7所示，解决峰形问题最终会影响色谱分离的效率、分离度和灵敏度。 图7. 过期甲氧氯普胺样品的分析，改性剂中分别添加不同的添加剂成分。将甲酸铵和甲酸组合，称之为&ldquo 类缓冲液&rdquo 系统，此系统可使样品中的所有分析物均获得最佳峰形。所使用的改性剂为50:50的甲醇/乙腈。 评估特异性 在确定可对选择性、分离度和峰形产生积极影响的方法条件后，各变量同时获得了优化。实验使用甲氧氯普胺和杂质（对照）的标准混合物和过期的样品混合物对最终方法进行了评估，如图8所示。有关未知杂质的进一步考察，请参阅沃特世（Waters® ）应用纪要。2 图8. 采用&ldquo 实验&rdquo 部分中列出的最终方法条件对甲氧氯普胺对照混合物和降解混合物进行的对比分析。 结论 本实验使用ACQUITY UPC2系统成功对甲氧氯普胺及其相关物质进行了非手性分析。了解杂质结构的特性有利于方法开发。实验中分析的多种杂质包括胺类、羟基、酯类和羧酸。能够影响选择性、分离度和峰完整性的主要方法变量分别是固定相、改性剂的洗脱强度和添加剂的组成。最后甲氧氯普胺相关物质的分析方法展示了此方法对过期甲氧氯普胺样品的特异性。 本方法开发过程通过色谱柱筛选处理中的对比实验揭示了多种[固定相 &ndash 分析物]相互作用。更多的相互作用需要在已发表的研究基础3-6上进行进一步的探索。了解这些方法变量相互作用的影响将有助于创建一种更加适用的方法开发技术。 参考文献 1. Jones MD, et al.Analysis of Organic Light Emitting Diode Materials by UltraPerformance Convergence C hromatography Coupled with Mass Spectrometry (UPC2 /MS).Waters Application Note 720004305EN.2012 April. 2. Jones MD, et al.Impurity Profiling Using UPC2 /MS. Waters Application Note 720004575EN.2013 Jan. 3. West C, Lesellier E. A unified classification of stationary phases for packed column supercritical fluid c hromatography.J Chromatogr A. 2008 May 1191(1-2):21-39. 4. West C, K hater S, Lesellier E. C haracterization and use of hydrophilic interaction liquid c hromatography type stationary phases in supercritical fluid c hromatography.J Chromatogr A. 2012 Aug 1250:182-95. 5. Lesellier E. Retention mec hanisms in super/subcritical fluid c hromatography on packed columns.J Chromatogr A. 2009 Mar 1216(10):1881-90. 6. Zou W, Dorsey JG, C hester T L. Modifier effects on column efficiency in packed-column supercritical fluid c hromatography.Anal Chem.2000 Aug 72(15):3620-6.