色谱电化方法

关于酒驾，国家近日发布了最新标准，将于2024年3月1日起实施。国家标准全文公开系统截图　　公共安全行业标准《生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空-气相色谱检验方法》等标准发布实施以来，为机动车驾驶人血液酒精含量检测提供了技术依据。　　全国刑事技术标准化技术委员会在进一步丰富优化该项行业标准检测分析方法、细化完善有关技术要求的基础上，组织制定了《血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇检验》(GB/T 42430-2023)国家标准。　　将进一步支撑法律和强制性国家标准落地实施，为各类鉴定机构开展血液中酒精含量检验技术工作提供标准方法。　　同时，该国家标准可适用于五种醇类物质及丙酮的中毒、死亡检验、医疗急救检验、科学研究等其他更为广泛的场景。　　该标准将于2024年3月1日起实施。　　新规酒驾和醉驾的区别在于违法程度和处罚力度方面　　更严：　　新国标将血液中乙醇的含量分为三个等级，而旧国标只分为两个等级。新国标将饮酒驾驶的上限从50mg/100mL降低到了20mg/100mL，也就是说，只要血液中乙醇含量超过了20mg/100mL，就属于违法行为。血液中乙醇含量大于或等于80mg/100ml的认定为醉驾。醉驾属于犯罪行为。　　更准：　　新国标将血液和尿液中乙醇的检测方法分为两种，分别是气相色谱法和电化学传感器法。旧国标只规定了气相色谱法作为实验室检测方法，而没有规定现场检测方法。　　更公：　　新国标将血液中乙醇含量与呼吸中乙醇含量之间的换算系数从2100调整为2300。这是基于最新的科学研究和统计数据，更符合中国人的体质和代谢特点。

前言：笔者还在读研究生的时候就听闻过厦大胡荣宗老师和他的离子色谱抑制器。该电化学离子色谱抑制器曾荣获国教委科技进部二等奖，获国家发明奖三等奖，并且胡老师将这项专利产品化，其产品在离子色谱用户中广受好评。日前，胡荣宗老师接受了本网(以下简称instrument)的采访邀请，笔者欣然前往，在风景秀美的厦大校园内完成了访问，当时情景至今记忆犹新。 厦门大学化学系胡荣宗教授 instrument：首先，我代表仪器信息网非常感谢胡老师能在百忙之中，抽出时间接受我们的采访。请胡老师简单的为我们介绍一下您的电化学离子色谱抑制器。 胡老师：离子色谱仪，使用电导检测器（ECD），通常使用酸、碱做洗脱液。但是，用酸、碱做洗脱液会产生背景电导，对电导检测器的检测结果影响非常大。如阴离子样品用碱来做洗脱液（比如说碳酸钠，氢氧化钠）那么背景电导比真实结果要高，最终会造成灵敏度降低。例如，用碳酸钠做洗脱液，将产生六、七百微西门子的背景电导，而目标化合物的电导也许不超过十微西门子，背景值是测定值的几百倍。许多分析工作者尝试使用各种化学方法来降低背景电导率，比如有人使用碳酸钠作为洗脱液，将钠离子置换成氢离子生成碳酸，达到降低背景电导率的目的；有人使用最简单的离子交换方法－交换柱解决背景电导的问题，但交换柱的再生操作太繁琐，实验效率较低；后来又有人使用离子交换膜的方式，膜内腔室里流的是碳酸钠溶液，膜外腔室流的是酸液，靠扩散来交换，这种方法十分不稳定，而且耗费大量酸液。 我们采用电化学方法解决电导背景的困扰，原理类似于大家都知道的电解水，在正极室产生氢离子而在负极室产生氢氧根离子，用电解水产生的氢离子置换淋洗液中的钠离子，这就是最简单的电化学抑制器的原理。这个方法我们学校大概在85年就提出了，而实际上， 82年我就已经开始在导师的指导下做这个课题了，一直做到现在（笔者感叹：已经二十多年了，真是厚积勃发呀！）。 我们这个项目是在国家第一个专利申请日申请的专利。我们在不断的改进，以前我们的电解液还要不断地更换，而现在，我们的电解液已经是靠检测后的尾液来提供了。我们在抑制器方面已经有了六、七个专利，都是不断改进、不断提高的成果。这个项目在89年获过国家教委科技进步二等奖，90年获过国家发明奖的三等奖。我至今还记得当时参选国家发明奖答辩时的情景，当时，评委问了我许多问题，其中一个是：“你的这个方法，国外有没有实验室或研究所在进行类似的研究呢？如果没有，为什么他们没有做呢？”那个时候的我还年轻，我说：“国外也有很多人在做，但是他们没有做出来。” instrument：像您这种产品有没有想过进行大规模的正规化生产？ 胡老师：我身为高校的教师是有教学任务的，另外还有课题和研究项目,这些工作都要按时完成，精力和经费的限制使我们的专利至今没能实现产业化批量生产。现在我们也和一些企业进行技术合作，也算是给我们的课题增加一些经费吧。 instrument：那么您的这些课题都是和谁合作的呢？ 胡老师：我们目前的合作伙伴是天美科学仪器有限公司，天美现在出售的离子色谱仪，配的就是我们的离子色谱抑制器。现在国内的离子色谱仪器生产厂家很多，有几家已经做得比较好了（胡老师向我们展示某品牌离子色谱抑制器产品）。我想，这种离子抑制器跟我的产品的设计原理是一样的，都可以归在电化学离子抑制器这个类别里面。而具体的区别在哪里呢？经过测试，我们的产品在性能上会更好更稳定，便于使用。我们的抑制器只有四条管道，比一般的电化学离子色谱抑制器的管道要少，管道少那么死体积就小，而且我们的产品是可以和某进口品牌的离子色谱仪相匹配，价格要比进口抑制器便宜很多。 instrument：现在国内这么多销售离子色谱仪器厂家，像戴安，万通，天美，他们用的离子色谱抑制器也是这种类型的么？ 胡老师：戴安公司的离子色谱抑制器也是电化学抑制器，万通公司的离子色谱仪是三柱循环再生原理的抑制器，而天美公司的产品主要配的是我们的抑制器。 色谱抑制器 instrument：那天美公司使用您的离子色谱抑制器，是直接从您这里购买还是他们拿回去以后要重新进行设计？ 胡老师：目前为止，天美还是直接使用我们的离子色谱抑制器。以后如果进行技术转让的话，天美可能会进行一定的改进。我们在离子色谱抑制器的销售方面投入不多，没有做任何宣传，因为我们并没有把赚钱看得很重，有点姜太公钓鱼愿者上钩的意思。很多零散用户打电话或上门购买我们的离子色谱抑制器，都是得益于离子色谱仪用户之间口耳相传的效果。批量销售主要还是面向天美公司。之所以跟天美合作，是比较看重天美的技术力量，我去天美参观过很多次，对他们在技术研发上的投入，他们的技术实力以及产品检测和管理都很满意。 instrument：我想您的这个专利应该在应用上不止局限于离子色谱抑制器方面吧？ 胡老师：当然，实际上很多领域都可以用我们的专利，像我们目前所做的一个课题，是化工脱硫胺液再生方面的，也是用这个原理。不过我们主要的研究方向还是以离子色谱为主。因为一个研究成果由发明到应用到商品化，不是那么容易实现的，要保证产品的稳定性，考虑产品的寿命，这些对于科研工作者来说是很难的。除了原理、工艺，还要考虑到工厂、客户之间的关系。 instrument：现在，国内的很多离子色谱厂家也发展起来了，您觉得这些离子色谱厂家的产品与国外同类型产品的差距主要在哪？ 胡老师：可能质量上，进口的产品还是要卡的紧一些。国内的厂家目前是比较追求“能卖出去就行的标准”。比如说，如果价格和进口的差不多，客户就会觉得花差不多的钱当然买进口的产品了，而如果厂家把国产的仪器价格压低出售的话，可能仪器的成本就要相应的压低，这是一个主要的矛盾。 instrument：胡老师，目前您主要在做哪方面的研究呢？ 胡老师：我们现在和其他几家单位合作，比如浙江大学，山东师大，兰州化物所等，争取作出国内的首台微型离子色谱仪。我们将使用一种全新的检测方式。当然，其他的现在还要保密。我们将推出新的型号的抑制器，更好的与国外名牌产品匹配。 instrument：这也是我们非常想要向您了解的，我们接触过很多的老师，这些老师也都有自己的研究成果，现在自己搭仪器的老师也很多。但是最终能够形成一个小规模的生产的非常的少。您看您现在将自己的成果产品化，又和厂家有一个批量的供求关系，请问您有什么心得吗？在大学里，研究所里的这些老师们，怎么样将研究成果产业化，这个过程中应该都注意些什么呢？ 胡老师：还是要投入。一个是研究的投入，一个是经费的投入。比如说你可以花费很多的时间去写论文去发表文章，而我却要用这些时间，去做产品模型，去看做成的产品模型。你看我们现在的产品，外观上非常漂亮，实际上在我的抽屉里，有一大堆各种各样的模型，这中间是要投入很多的。另外一个就是经费的投入，当然我们在经费方面能申请国家的资金资助，这是一方面的投入，另外在横向也很重要。比如我们将产品供应给天美，也会获得一定的收入。我们把产品卖出去获得的收入，真正给我自己的是非常少的。也不是说不能将这部分据为己用，因为如果光靠纵向的国家基金，实际上十分紧张，比如说我们在选材，做膜的过程中，也会和很多的工厂打交道，遇到这样或那样的问题，我们翻来覆去的做模，这就需要我们在资金上不断的投入。还有一个，就是要有决心，要有一种我就是要让它好用的决心，比如说在做模的过程中，有两三次，工厂那边的人对我说：“你就让它定下来，别老想改动。”我就是老想着改成这样了以后，还想着改成更好，比如说我们的产品，工厂那边的人就会觉得很奇怪，你们有了大的为什么还要小的，我就对他们说，小有小的好处，大有大的用处。这个小的，如果淋洗液浓度不太高，那么它的灵敏度，死体积，都会有一个更好的表现。而我们另一个比较大的抑制器，就适合容量比较高的样品。因为很多的用户，单位，可能做不到梯度淋洗，像这些用户只需要单用，而单用就不需要配容量大的抑制器。考虑到两种不同的需求，我们做了两个型号的离子色谱抑制器。当然从产品多样化的角度讲，我也会希望自己的产品，种类多些。我们这个课题组，在实用方面上，实际下的功夫比较多。 厦大风景 instrument：从我们的角度来看，现在有太多的实验成果都烂在实验室里了，像现在，有很多项目，完成之后就扔在实验室，实际上国家投了那么多钱，可能更希望的是能够作出一个实实在在的东西。如果能将这些成果应用于科学研究，我觉得这才是更好的。我觉得国家在资金上支持科研成果产业化是对的。因为在产业化的过程中是需要不断的资金的投入。与公司合作去搞一个产品，与找课题申请一个项目，这两者之间的主要差别在于哪里？可能我们从事科研的老师一直以来都缺少市场刺激这方面的压力，那么您觉得您的压力主要来自于哪里？ 胡老师：人总是要有一点压力。我的压力不是来自于经济方面，而是主要来自于我的产品别人用起来会不会觉得好用。实际上我们每出售一台抑制器，我个人所获得的收益是很少的，我们会将更多的收益投入到接下来的研究中，这也是一个横向的投入。比如产品上的螺丝，以前我们用的是手制的，现在我们要和国际接轨，也要开始使用特制的螺丝。这种螺丝拿来以后要去试好拧不好拧，我的要求是用手就可以拧紧。很多因素要考虑，尝试一次不行就两次，这些东西都非常地小，小到一个螺丝，但是都是我们要考虑到的。所以我们的产品也是在不断的改进，不断的投入，要让用户觉得好用，另外产品方面需要考虑的就是美观，最早天美认为我们的产品外观不好看，不像产品。经过我们不断的改进，现在的产品外观看起来美观多了，最终我们还是希望将技术转让给需要的规范化企业。 编后语：摆在我面前的这两个小小的离子色谱抑制器凝聚着胡老师二十多年的心血，这其中的付出与坚持除了胡老师自己，旁人无法深刻的体会到。也许面对今日的成功，往日的付出和往日的艰难困惑都可以谈笑而过。整个采访过程中，胡老师始终是面带笑容，知无不言，言无不尽，而我们却可以在言谈中体味到胡老师对科研工作的执着。借用一句话来形容便是：“风，又起；树，尽摇；阳光，不屈不挠”。我衷心的希望，胡老师的微型离子色谱能够获得更大的成功，也希望能有更多的科研工作者能够像胡老师一样，走到将研究成果产业化的道路上来。 胡荣宗老师简介： 胡荣宗，男，汉族，1945年10月生，福建省厦门市人，中共党员，大学本科毕业于北京大学技术物理系，研究生毕业于厦门大学化学系，获理学硕士学位。1973-1974被国家选派至日本岐阜大学进修。教授，博士生导师，长期倾心于电化学，电分析化学，微柱色谱，离子色谱电化学的研究。主持和参加多项国家和省自然科学基金项目，省科技项目的研究和开发。获授权专利14项（其中第1发明人9项）。作为课题组长，《高性能智能化离子色谱仪的研制与开发》等四项科研成果通过省级鉴定，作为课题组长（第2发明人）《离子色谱抑制柱》1989年获国教委科技进部二等奖，1990年获国家发明奖三等奖，1992年获福建省专利一等奖。1993年起享受国务院颁发的政府特殊津贴，1997年被授予福建省优秀专家。 胡荣宗教授的专利成果和联系方式： 专利： 1 02131711.9 电极电解液室一体化的电化学离子色谱抑制器 2 85102998 离子色谱抑制柱 3 89102557.X 流动体系电流检测器 4 89102556.1 流动体系低噪音库仑检测器 5 89101310.5 毛细管等速电泳仪的进样装置 6 91105113.9 电迁移微离子色谱仪 7 99120177.9 细菌还原法制备负载型金催化剂 8 01265637.2 分立电源式多功能离子色谱抑制柱 9 92202899.0 阴、阳离子双功能离子色谱抑制柱 10 96205793.2 五槽式除盐电渗器 11 98209944.4 高容量离子色谱抑制柱 12 00241733.2 分立电源式高容量离子色谱抑制柱 13 200410069590.X 快速消除双电层充电电流误差的脉冲极谱和电化学谱方法 14 200610059307.4 脱硫胺液中热稳态盐的电化学去除装置 15 200710008600.2 离子色谱电势差检测池 16 200520128004.4 柱状薄层电自生式离子色谱抑制器 （注；其中1、8、9、10、11、12、14、15、16为第一发明人。） 联系方式： 通信地址：厦门大学化学化工学院化学系（361005） 联系电话：0592-2184358 email: rzhu@ xmu.edu.cn

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins1。该文章的通讯作者是来自荷兰伊拉斯姆斯大学医学院的Martijn M. Vanduijn研究员。许多蛋白质中都包含着二硫键，二硫键是指连接不同肽链或同一肽链中两个不同半胱氨酸残基的巯基组成的化学键（-S-S-）。在蛋白质分子中，二硫键起着稳定肽链空间结构的作用。二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界影响的能力就越大。维持二硫键的完整有利于蛋白质的液相色谱分离，但却给后端的质谱分析带来了挑战。常规的方法是在质谱分析前期对蛋白质进行变性、还原、烷基化处理，这些前处理过程可以有效的减少二硫键对后续酶切或二级碎裂（MS/MS）的干扰，但却非常繁琐耗时，除了会产生副反应以外，蛋白样品也可能在前处理过程中发生丢失。一个有效的替代方法是采用电化学还原。一个配备金属电极的流通池，仅需要施加适当电压于电极上，流通池中蛋白分子上的二硫键就可以被还原。目前，这种微型电化学反应池已实现商业化，可在线连接至质谱前端，蛋白样品经电化学还原，离子源活化，二级碎裂后可直接进行基于MS/MS谱图的序列匹配。尽管如此，电化学反应池在设计、电极材料组成、流通池的大小以及施加的电势等方面仍在不断的提高与创新。免疫球蛋白（抗体）包含有多个链间/链内二硫键。Simone Nicolardi等人曾在2014年将电化学反应器与FTICR质谱联用用于单克隆抗体的分析，从MS1谱图中可以明显地观察到单克隆抗体由于链间二硫键还原后生成的重链和轻链。然而，由于还原不完全，导致重链/轻链上的链内二硫键仅部分打开。类似的不完全还原在Kasper D. Rand组中电化学还原与氢氘交换质谱联用中也能观察到。这种不完全还原会影响蛋白中肽链的精准测量（一对二硫键引起2 Da的质量偏差），同时，关闭的二硫键也会干扰其跨度区域的二级碎裂，碎裂产物也较难通过计算软件进行预测或分析。本文介绍了一种改进的在线电化学还原方法可以实现单克隆抗体链间/链内的完全还原。装置如图1所示，蛋白样品注入系统后在1μL/min的流速下进行色谱分离，色谱柱后流出液与19 μL/min的补充液（1%甲酸，50%乙腈）在T型管中混合，随后以20 μL/min的流速经过电化学反应池（电化学反应池固有体积为19 μL），最终还原后的反应液进入质谱进行检测。值得注意的是，补充液中的50%乙腈有利于蛋白变性，而1%甲酸则为还原反应提供氢原子，促进还原反应的进行。图1. 在线电化学反应池耦联质谱装置示意图为了考察整个方法的可行性及普遍适用性，作者利用该装置对一系列的单克隆抗体进行了电化学还原和质谱检测。如图2A为贝伐珠单抗在800 mV还原电势下色谱分离的总离子流图（TIC），图2B为图2A中色谱峰所对应的一级质谱图（MS1）。从MS1可以看出有两组电荷态分布分别对应重链和轻链，说明在800 mV电势下，贝伐珠单抗链间二硫键发生了还原，由于还原发生在色谱分离之后，所以重链和轻链产生了共流出，仅在TIC图中观察到一个色谱峰。相比较柱前还原，这种色谱柱后二硫键还原会导致肽链的共流出，质荷比接近的肽链则会产生重叠的电荷分布进而干扰谱图的解析。但这种方法在分析复杂的蛋白样本具有明显有优势，可以将还原后生成的肽链与蛋白母体相关联，方便溯源。图2C则为贝伐珠单抗在不同电势下的还原情况，随着电势的逐渐增加，MS1去卷积谱图上逐渐观察到部分还原生成的重链、轻链或重轻链组合，当电势达到1000 mV时，几乎所有的链间二硫键都实现了还原。对于链内的二硫键，由于还原产生的质量改变较小（轻链包含两个二硫键，还原后质量增加4.032 Da），且存在未还原、部分还原以及完全还原肽链间的信号干扰，所以不太容易从MS1谱图确认链内二硫键的还原情况。但轻重链朝高电荷态偏移（图2D）间接说明链内二硫键在打开，肽链更加舒展，更容易质子化。图2. 在线还原系统分析贝伐珠单抗：A）贝伐珠单抗总离子流图；B）对应色谱峰的一级质谱图；C）在不同还原电势下的一级质谱图（去卷积）；D）重链在不同还原电势下电荷态的偏移。为了更加准确地评估链内二硫键的还原情况，作者模拟了不同氧化还原态的贝伐珠单抗轻链19+电荷态的同位素分布情况。如图3A，从上到下分别是模拟的完全还原（4 x SH）、部分还原（SS + 2 x SH）以及未还原（2 x SS）同位素分布。将实验测得同位素分布与模拟的同位素分布进行比对，计算每种氧化还原形式对总信号的贡献占比（图3B）。经过比对发现在1000 mV的电化学还原下是可以实现链内二硫键的完全还原的。因此，最终电化学还原设置为1000 mV。链内二硫键的完全还原可以极大的提高肽链的碎裂效率，获得更加丰富的MS/MS数据用于序列匹配。如图4所示，贝伐珠单抗以及西妥昔单抗的轻链19+电荷态被分离并碎裂。可以看到当施加1000 mV还原电势在质谱分析的前端时，轻链的二级碎片明显增加，特别是横跨链内二硫键的区域（图4，黄色阴影）。此外，在质量匹配的过程中也可以观察到二硫键处于还原状态，考虑还原氢引起的质量增加可以实现更多二级碎片的匹配。图3. A）不同氧化还原态的贝伐珠单抗轻链19+电荷态的同位素分布模拟；B）不同实验条件下的二硫键还原情况图4. MS/MS数据评估链内二硫键的还原情况总之，本文开发了一种在线电化学还原方法能够实现免疫球蛋白链间/链内二硫键的完全还原。该方法能够简化蛋白样品的前处理过程，方便后续的质谱测定。与之前的电化学反应器相比，该系统能实现链内二硫键还原的主要原因可能有以下几点：1、电化学流通池所用的表面材料，之前是全钛的设计，现在是表面镀铂。2、之前是三电极配置（工作电极，参比电极，辅助电极），而现在的设计减少至两个电极，驱动还原的电势适用于这种调整后电极配置。3、补充液的条件（50%乙腈和1%甲酸）对还原有利。此外，该电化学系统仍有需要改进的地方，例如：电化学反应池的体积过大、还原电势过高会影响质谱检测的信噪比等。该方法具有广阔的应用前景，无论是在蛋白质组学还是在结构质谱分析中。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins参考文献1.Vanduijn MM, Brouwer HJ, Sanz de la Torre P, Chervet JP, Luider TM. Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins. Anal Chem. 2022, 94(7): 3120-3125. 2.Nicolardi S, Deelder AM, Palmblad M, van der Burgt YE. Structural analysis of an intact monoclonal antibody by online electrochemical reduction of disulfide bonds and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal Chem. 2014, 86(11): 5376-5382.3.Trabjerg E, Jakobsen RU, Mysling S, Christensen S, Jørgensen TJ, Rand KD. Conformational analysis of large and highly disulfide-stabilized proteins by integrating online electrochemical reduction into an optimized H/D exchange mass spectrometry workflow. Anal Chem. 2015, 87(17): 8880-8888.