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先和大家唠唠青霉素酶的主要来源:奶牛每到换季容易发作乳腺炎等疾病,往往通过注射抗生素进行治疗。凡经治疗过的乳牛,其牛奶在一定时期内残存着青霉素,而在原奶收购检测时,抗生素超标会拒收,奶户为了私利会人为添加青霉素分解酶。别小看这东东,个人认为危害大着呢:1.青霉素酶的安全性以及是否可以在食品中添加尚未有定论。2.在分解青霉素后,可能引进其他有害物质。3.这种做法纵容了奶牛饲养过程中抗生素的滥用。(这三条都个人主义的看法 仅供参考)一.杯碟法检测原理:采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株,利用舒巴坦特性抑制β-内酰胺酶的活性,并加入青霉素作对照,通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。二.实验试剂与材料1 菌种:藤黄微球菌,对青霉素较敏感,有青霉素存在时藤黄微球菌不会生长繁殖(如图)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081621_492377_2227357_3.jpg2 试剂及药品1)磷酸盐缓冲液(配药):取8g磷酸二氢钾和2g磷酸氢二钾,用1000ml溶解,121℃高压灭菌15min。2)舒巴坦标准储备溶液:将舒巴坦标准品用磷酸盐缓冲液溶解并定容为10mg/ml。4℃保存,可使用一周。3)舒巴坦标准工作溶液:吸取100ul舒巴坦标准储备溶液到1ml离心管中,用磷酸盐缓冲液定容,配置成浓度为1mg/ml。4)青霉素标准储备溶液:用磷酸盐缓冲液将青霉素溶解并定容为10mg/ml, 4℃棕色瓶中保存。使用时间根据实验情况而定。5)青霉素标准工作溶液:吸取10ul青霉素标准储备溶液于1ml离心管中,用磷酸盐缓冲液稀释,配置成浓度为0.1mg/ml ,4℃保存,可使用一周。6)生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中, 121 ℃高压灭菌15min。7)B-内酰胺酶标准储备溶液和工作溶液:方法要求16000U/ML(依据实际检验情况定浓度),目前用的是8千单位。如购买的青霉素酶的单位有IU/L,U/L,单位/ML,它们的换算关系是:1IU/L=609U/L=0.609单位/ML.8)无菌水:121℃高压灭菌15min。9)抗生素1号培养基,营养培养基。注:于配制药品的容器如不能高压灭菌,需用75%的酒精进行2-3次的消毒,再用所使用的无菌溶剂(生理盐水和磷酸盐缓冲液)进行2-3次的润洗后再进行药品的配制.3 主要实验器材http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081629_492378_2227357_3.jpg三.实验步骤1.试样处理:把离心管放入微孔中,标记为A、B、C、D,取试样1000ul分别放入A、B、C、D四个1.5ml离心管中,每个样品做三个平行,共12管。同时每次检验应取纯水1ml加入到1.5ml离心管中做对照。如样品为乳粉,则将乳粉按1:10的比例稀释,如样品是酸性乳制品,应调节PH值至6-7后,按顺序加入以下药品后混匀。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081633_492379_2227357_3.jpgA: 5ul青霉素标准工作溶液。B: 25ul舒巴坦标准工作液+ 5ul青霉素标准工作溶液。 C: 25ul β-内酰胺酶标准工作液+ 5ul青霉素标准工作溶液 。D: 25ul β-内酰胺酶标准工作液+ 5ul青霉素标准工作溶液+25ul舒巴坦标准工作液。2.菌悬液的制备1)菌种的制备:将营养琼脂培养基分装到试管中做成斜面,用接种环挑取适量藤黄微球菌在斜面上划线,36 ℃培养22-24h。2)菌悬液的制备:用2ml生理盐水将经过斜面培养的藤黄微球菌洗下,混合均匀,然后将菌悬液以大约2%的比例加入到营养琼脂培养基中。3.检定用平板的制备1) 在无菌培养皿中注入抗生素1号培养基10ml,作为基层培养基,水平静置,待其自然凝固后将皿盖盖好备用.2)2.将灭菌的营养琼脂培养基溶化后在水浴锅中冷却至55℃左右,加入适量的菌悬液,混匀,移取5ml含有浓度为1*108CFU/ml注入铺有基层培养基的培养皿中,均匀摊开,凝固。加入菌悬液的量以能产生17-27mm的抑菌圈为宜。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081639_492380_2227357_3.jpg3).凝固后将皿倒置,用笔在皿上画十字线,将皿平分四份,并标记样品的序列号,与原始记录对应。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081641_492381_2227357_3.jpg4).然后再把皿反转,在每个培养基表面均匀对称放置4个牛津杯。检定平板应为同一批次。放置牛津杯时,必须均匀对称的放置,以免各自产生的抑菌圈有交叉现象。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081642_492382_2227357_3.jpg4. 试样测定 1). 取ABCD四个离心管中的试液各200ul,分别加入到检定平板的四个牛津杯中,每组试验做3 -4个平行样。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081644_492383_2227357_3.jpg2)培养结束后去除牛津杯用游标卡尺精确测量ABCD四个试液的抑菌圈直径。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/03/201403081646_492384_2227357_3.jpg四.结果判定取ABCD抑菌圈直径的平均值,纯水空白结果应为A、B、D、均产生抑菌圈;A的抑菌圈与B的抑菌圈相比,差异在3mm以内(含3mm),C的抑菌圈小于D的抑菌圈差异在3mm以上(含3mm),且重复性良好。如此结果则系统成立,可对结果进行如下判定。样品结果B和D均产生抑菌圈,且D-C抑菌圈在以上3mm(含3mm)时,可以判定样品中A和B的抑菌圈差异小于3mm ,且重复性良好的青霉素酶结果为阴性;样品中A和B的抑菌圈差异大于3mm (含3mm) ,且重复性良好的青霉素酶结果为阳性;纯水空白对照品系统成立的情况下,为判定样品结果的前提条件。如果A和B均不产生抑菌圈,
①在不含抗生素的奶中按所需浓度加人青霉素溶液,使对照中抗生素浓度与测试的 检出限制水平一致。以此作为对照管兄外,检出限还取决于所用菌株的敏感性。使用 枯草芽孢杆菌时,对照管中培养基青霉素的含量为0.05单位/mL;使用嗜热脂昉芽孢杆 菌(热乳芽孢杆菌)吋,育霉素含量为0.02单位/mL, ②在40~50℃吋,将lmL处于指数生长期的营养肉汤培养物加人5mL熔化的营养 琼脂培养基中,然后倒人培养皿,置于橾作台上使之凝固,按要求标记底板。 ③使用洁净干燥的镊子,将一片无菌空白抗生素纸片(直径13mm,Difco)浸入充分 混合的样品中,控掉多余奶液,将纸片放在平板中合适的位置,冲洗,擦干镊子,进行对照 和其他样品的测试。 ④将平皿置于适当的培养温度(30℃培养枯草芽孢杆菌或50℃培养嗜热脂肪芽孢 杆菌).直到生出菌落或培养至规定的时间。 ⑤检查平板,将样品的抑菌圏直径与对照进行比较,当样品的抑菌圈直径小于对照 时,样品合袼;当样品的抑菌圈直径等于或大于对照抑菌圏直径吋,且经内酰胺酶处 理后样品的抑菌圈直径小于未用β-内酰胺酶处理的样品抑菌圏直径时,样品中含有 内酰胺类抗生素。当样品抑菌圏等于或大于对照时,用内酰胺处理后样品抑菌圏的 大小不变,则应将样品加热,破坏样品中的其他抑制物质,然后再次检测(或将未经加热和 加热的样品同时检测)。若样品中抑制物浓度等于或大于对照浓度时,试验失败。
实验室工作7年了,很多人问我怎要才可以把实验做好,做得漂亮。对于这个问题,我再看看到很多做事毛糙,手忙搅乱的师弟师妹时,只能笑而不语。生物实验不是化学实验,很少会爆炸,真的没必要慌乱,和很多工作一样,需要用“心”去做。 不说废话,回归正传。今天谈谈“含抗生素平板培养基的配制窍门”。当然,对于很多做这个实验做得炉火纯青的同行,实在没必要看下去了。下面写的只是供那些在这个环节不太了解的朋友看。 基本步骤如下: A.琼脂、蛋白粉、无机盐、…..去离子水….等等,混匀,溶解,具体成分看你培养神马菌了; B. 120度,高压灭菌; C. 加抗生素,加神马抗生素,看你要筛选神马菌,氨苄青霉素?链霉素?潮霉素B? D. 倒平板。 别以为这个大家都会。讲一个真实故事给大家听,以前有一个做实验也是蛮拼的同学,要做含青霉素的筛选平板培养基,他一次不成功,就做第二次,但是还是不成功,一直做了2个月还是不成功。。。他的科研热情实在值得学习,只是财力不是很雄厚的老板实在伤不起。我们好奇,怀疑他没加青霉素,就问他加了没,他回答时也很有底气,自信地告诉我们,加了,加了不少------可惜都是在高温灭菌前加的!如此高温,哪家的抗生素不分解啊? 在这里,我想强调的是,加抗生素,除了要选择时,还要择温度!加抗生素必须在灭菌之后加,加的时候一定要等琼脂培养基凉下来再加。温度降到什么时候为宜呢?就是45~50度的范围。当然,有些牛人,靠手摸,感觉不烫,就刚好是45~50度。作为搞科研的,我不推荐用这种方法。我推荐大家用恒温循环水浴。建议不要用国产的水浴,因为隔壁实验室发生过漏电事件……我用过几个进口品牌,发现德国IKA的恒温水浴最好,安全,精准,好用。可惜当时递交采购单时太草率,就选了一个基本型的ICC恒温水浴。五楼的小黄老师有钱就这么任性,挑了个IKA控制型,可以远远的无线控制~~听说无线控制距离可达10米~~~ 45~50度是一个很合适的温度,一方面可以保持抗生素的活性,另一方面,琼脂在这个时候不凝。轻轻晃动几下培养基,让抗生素混匀,切忌不要使劲,否则起了起泡就很难看了。后续,只要小心的把培养基倒到培养皿上,于是高质量的含抗生素的培养基就做好了~