有关物质色谱条件

李昌厚(中国科学院上海生物工程研究中心上海200233)　　摘要　　本文重点讨论了光谱分析测试工作中的一些最重要的关键问题，即：如何选择原子吸收分光光度计(AAS)、紫外可见分光光度计(UVS)、激光拉曼光谱、原子荧光和形态分析等光谱分析仪器的仪器条件；同时，还讨论了仪器学理论和做仪器与用仪器之间的关系等问题。　　0、前言　　分析仪器使用者的根本任务，就是用好分析仪器。所谓“用好”，就是选择最佳仪器条件，保证得到最佳分析测试数据，或分析误差最小的分析测试数据。因此，使用者对仪器条件的选择就非常重要了，它是用好分析仪器、把仪器用到最佳状态、保证得到可靠的分析检测数据的最关键、最根本问题。本文根据仪器学理论、分析化学理论和本人长期研发、使用各类分析仪器的实践，对光谱分析工作中有关分析仪器条件等问题进行了讨论。　　作者在天津大学精密仪器系光学专业，受了五年仪器学的熏陶，毕业后分配在中国科学院工作，长期既研发分析仪器，又使用分析仪器，包括AAS、UVS、激光拉曼、原子荧光等光谱仪器和色谱仪器等。所以，作者对仪器学理论和做仪器与用仪器之间的关系非常重视，并且进行了认真研究。本文将根据作者长期的实践、经验和教训，讨论用好这些光谱仪器的关键问题，以供有关的光谱分析仪器研发和使用光谱分析仪器的科技工作者参考。　　1、AAS[1]　　使用者要用好分析AAS仪器，选择仪器条件非常重要，例如：火焰AAS有36个条件需要选择、石墨炉AAS有48个仪器条件需要选择，其中只要有一个条件选择不合适，就有可能做不出数据。又例如：石墨炉AAS的四种温度(干燥温度、灰化温度、原子化温度和静化温度)的选择就非常重要。干燥温度是去掉样品中的水分或溶剂，一般水样选择100℃、有机溶剂选择120-130℃。但是，有科技工作者对水样选择干燥温度80℃，对有机溶剂样品选择干燥温度100℃。水要100℃才能完全蒸发，80℃怎么能除掉样品中的水分呢?有些有机溶剂要130℃以上才能挥发，100℃的干燥温度怎么能去掉样品中的有机溶剂呢？因为干燥温度选择不对，不但不能去掉样品中的水分和有机溶剂，不能很好的完成实验，不能得到可靠的分析检测数据，结果反而石墨管也断掉了；挥发温度选择不对，杂质挥发不掉、或者将样品也挥发掉了 原子化温度选择不合适，样品不能完全原子化；静化温度选择不当，上次测试的样品残留物还在石墨管中，这些都将严重影响分析测试误差。　　又如：AAS使用中的调零问题。AAS的调零分为仪器调零和空白调零两种。所谓仪器调零，是消除由于仪器的噪声、漂移、外界干扰等因素造成的仪器零点不在原位的情况，主要是通过仪器的光学、机械、电子学、计算机等来实现仪器归零。如果AAS仪器的调零不好，整个分析过程中，仪器都不可能稳定，不可能得到可靠的分析测试数据。所谓空白调零，就是利用空白溶液校正仪器测试样品前的综合零点。这是AAS分析工作者用好仪器、保证分析结果的可靠性最重要的一步。有些分析工作者，为了省事，不管对什么样品的分析，一律用蒸馏水作为空白来调零。这是很不妥的。因为AAS分析的试样越稀，误差越大。所以分析工作者一定要注意调零的问题，不能不分具体情况，盲目用蒸馏水调零。一般来讲，使用3倍最小检测限的溶夜或0.5%的硝酸水溶液调零为最佳。但还要注意试样的PH值，要保证试样与空白的PH值接近，否则，会出现负峰。　　还有分析线的选择、样品PH值的调节问题等都是用好AAS的关键之一。分析线的选择要特别注意四个原则：　　(1)稳定性：　　不同的吸收线,稳定度有差别。在灵敏度能满足要求时应从稳定度来考虑选吸收线，有些元素有几条灵敏度相差不大的吸收线，如:Co 240.7和242.5 Fe 248.3和248.8 Bi 223.1和222.8nm，可从谱线稳定度和减少干扰等方面考虑选择适当的吸收线。　　(2)干扰度：　　选择分析线应该尽量避免干扰,例如：Ni的305.1nm处线性好,谱线单一,干扰小；而Ni的232.0nm处，附近有其它非吸收线干扰(Ni 232.0附近有Ni 231.98、Ni 232.14、Ni 231.6等谱线干扰，即使用很小的SBW也很难将它们分开)。所以，分析检测Ni时，从干扰度角度看，Ni305.1nm优于Ni232.0nm。而且，有时宁愿牺牲灵敏度，而选吸收系数稍低的Ni341.48作吸收线也是比较好的。　　(3)吸收背景：　　吸收线的选择还要考虑背景干扰。如:Pb 217.0nm处的背景吸收较大，测定精密度较差，目前一般选次灵敏线Pb283.3nm作吸收线。　　(4) 共振线：　　共振线在红外区和真空紫外区的元素，应选次灵敏线。例如K，不用红外区的K766.5nm，而用K404.4nm；Hg 不用Hg 184.9 nm而用253.7nm。之所以如此考虑，主要是因为光电倍增管的光谱响应区，一般不在红外区和真空UV区的缘故。　　此外，还有很多关于火焰AAS和石墨炉AAS使用时需要使用者认真选择的仪器条件，因为篇幅所限，此不赘述。请读者参阅作者在北京科学出版社出版的专著：李昌厚，《原子吸收分光光度计仪器及其应用》，北京：科学出版社，2006。　　PH值的调节非常重要，如果PH值调节不好，可能出不了峰，有时甚至出倒峰。有时只要改变零点几的PH值，就可以得到很漂亮的峰形(请读者参考作者的原子吸收专著或论文)。　　2、UVS[2]　　要用好UVS不是一件简单的事情，有很多仪器条件需要认真选择，否则，也不可能得到最佳的分析检测数据，甚至什么也测试不出来，除仪器的波长、样品的溶剂、样品浓度等等[2]的选择外，还有很多仪器条件需要认真选择，例如灯电流大小、积分时间等等。特别是很多科技工作者不太注意、不大重视的光谱带宽的选择。　　没有真正认识光谱带宽是UVS仪器主要分析误差的来源之一。甚至，有的分析工作者，根本就没有认识到光谱带宽会影响分析误差。作者在长期的实践中深深体会到，光谱带宽是非常重要的技术指标，并在实际工作中对它进行了认真研究。为了研究光谱带宽对分析误差的影响，作者曾对青霉素钠、青霉素钾进行过分析测试研究。我国药典过去规定对青霉素钠、青霉素钾的分析测试用1nm光谱带宽，但作者对同一种浓度的青霉素钠进行分析测试发现：用2nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.805Abs；用1nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.825Abs；用0.3nm光谱带宽测试时， 吸光度值为0.865Abs；用0.2nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.823Abs。实践证明，0.3nm光谱带宽测试时吸光度值最大，2nm光谱带宽测试的结果比0.3nm光谱带宽测试时吸光度值小0.060 Abs，1nm光谱带宽测试时吸光度值比0.3nm光谱带宽测试时吸光度值小0.04Abs。说明，0.3nm光谱带宽是最佳光谱带宽。2nm光谱带宽测试时的吸光度值和0.3nm光谱带宽测试时的吸光度值绝对误差△A为0.06Abs，相对误差为△A/A=0.06/0.865=0.69(6.9%)；1nm光谱带宽测试时的吸光度值和0.3nm光谱带宽测试时的吸光度值绝对误差△A为0.040Abs，相对误差为△A/A=0.046(4.6%)。由此可见，光谱带宽的重要性是不言而喻的。但是，在实际工作中，有许多科技工作者很不重视光谱带宽问题。例如：我国某地的某某制药厂，采用国外某公司的UVS作为质检仪器，选择该仪器的光谱带宽为5nm，根本不符合我国和世界各国药典规定用于药品检验的UVS其光谱带宽应为2nm的要求。作者从理论上计算，5nm光谱带宽的紫外可见分光光度计，若要用于药品检验，其测试误差为3%。而很多药品检验时，药典规定要求其分析误差在1%以内。作者将此问题和青霉素钠等问题，向国家药典委的有关专家反映后，引起了重视，所以今天的我国药典对药物分析检测时的光谱带宽没有硬性规定了。因此，作者认为为了得到准确可靠的分析检测数据，减少分析检测误差，使用者一定要高度重视对UVS光谱带宽的选择。　　作者认为光谱带宽选择的原则应该注意两点：　　第一，根据分析工作的误差要求选择光谱带宽。因为不同的光谱带宽对同一种物质进行分析测试，有不同的误差，所以，不同行业对光谱带宽有不同的要求。使用者应根据分析工作的误差要求来选取不同的光谱带宽，特别是制药行业、科研工作或要求较高的使用者，更应如此。　　第二，光谱带宽不能过大或过小。我们应该选择样品的最佳光谱带宽或选择靠近最佳光谱带宽的光谱带宽来分析检测，才能得到最佳分析结果。　　有些科研工作者以为光谱带宽越小越好(分辨率高)，也有科研工作者以为光谱带宽越大越好(能量大，灵敏度高)。其实不然，如前所述，作者对同一浓度的青霉素钠、青霉素钾的测试就不是这样：0.3nm光谱带宽测试时吸光度值最大，比0.3nm光谱带宽大和比0.3nm光谱带宽小的时候，分析测试的数据都比0.3nm光谱带宽小，说明0.3nm的光谱带宽是最佳光谱带宽。　　认真选择线性动态范围(Linear Dynanic Range-LDR)也是UVS使用者应该重视的问题，这个问题目前还有很多使用UVS的科技工作者没有重视。线性动态范围可以定义为：被分析试样的最大吸光度Amax(保证相对误差为1%时的最大吸光度)除以被分析试样的最小吸光度Amin(保证相对误差为1%时的最小的吸光度)，即Amax/Amin。线性动态范围应该是国际上广大药物分析工作者和分析化学工作者们对UVS梦寐以求的一项关键技术指标。可惜我国广大的UVS使用者目前还没有对线性动态范围引起应有的重视。如果一台UVS的线性动态范围很大，那么，它对很浓的试样不需要稀释、对很稀的试样不需要浓缩，都能保证分析误差达到药典规定的相对误差在1%以内的要求，这无疑是一台好仪器。日常工作中，经常听到有人说，试样很浓不要紧，稀释一下就行了 或者说试样很稀不要紧，浓缩一下就行了。但是，他们不知道，“稀释一下”，“浓缩一下”谈何容易，会增加多少麻烦，会带来多少误差。我们说，在日常的分析测试工作中，应该尽量避免对试样作稀释或浓缩。这样，既减少麻烦，又有利于提高分析测试数据的可靠性。　　为了保证分析测试误差在要求的范围内，使用者在分析测试时，一定要注意使用UVS的最佳线性区。否则，不可能得到可靠的分析测试结果。作者长期使用国产TU-1901UVS，曾经实测过TU-1901UVS的线性动态范围，发现其能保证1%相对误差的最小吸光度Amin可到达0.04Abs(至少0.05Abs)，能保证1%相对误差的最大吸光度Amax可到达2.2Abs，其线性动态范围为Amax/Amin=2.2A/0.04A=55以上；但作者也曾测试过某国产UVS，发现其能保证1%相对误差的最小吸光度Amin仅为0.3Abs，能保证1%相对误差的最大吸光度Amax仅可到达1.2Abs，其线性动态范围Amax/Amin=1.2Abs/0.3Abs=4！后来，作者仔细研究，发现国产的TU-1901UVS的杂散光为0.01%，噪声为±0.0004Abs，而被测试的某国产紫外可见分光光度计的杂散光为0.3%，噪声为±0.005Abs。因此，作者得出结论：UVS的线性动态范围，完全由仪器的杂散光和噪声决定。若要保证UVS的线性动态范围，则必须先保证杂散光和噪声都很小才行。　　目前，国外有些UVS产品的杂散光很小(有的达到百万分之几)，扫描速度也很快，但是他们不给出仪器的噪声，作者认为是不对的。作者曾对有些不给噪声的国外UVS作过实测，发现他们仪器的噪声很大。如果UVS的噪声大，仪器的信噪比就会很小，它对稍微稀一点的试样就无法检测。因此，UVS的使用者和制造者，一定要特别注意重视仪器的杂散光和噪声。作者的实践证明：如果使用者发现UVS仪器的杂散光和噪声都很大，则该仪器的线性动态范围一定会很小，此时应做线性动态范围检测，以保证用在仪器的最佳线性区。　　此外，要用好UVS，还必须注意防止试样的光解。什么叫光解?光解是指试样在紫外光的照射下，会发生化学反应，可能减少被检测物的浓度、也可能由于化学反应产生了对入射光有吸收的新的物质。试样的光解问题，是从事UVS的分析工作者会经常碰到的一个棘手的问题，许多使用者，特别是年轻的分析测试工作者，因为缺乏经验，碰到试样的光解时往往不会判断，反而认为是仪器不好，去找仪器的问题，结果事倍功半。如：上海某某制药厂，生产酞丁胺，他们在用UVS作质量检验时，将酞丁胺溶解在50%酒精中，测试波长选为347nm，结果，发现很不稳定。他们每隔半小时测试一次，经过几天的测试，数据始终在波动(始终向偏小的方向变化)，根本无法稳定下来，因此，他们开始怀疑仪器有问题。但经过制造厂的维修工程师检修，仪器完全正常。经过很长时间的争论，最后，发现是试样存在光解的问题，即在347nm的紫外光的照射下，试样因为产生光化学反应，浓度一直在变化，进而导致测试数据根本无法稳定下来。又如有些维生素类的药物也会有光解现象，如：某某制药厂，生产维生素B12，根据规定，他们在自己厂里用国产或进口的UVS对维生素B12质检后，还要将厂里质检过的产品送到当地地区药检所去复检以判断产品是否合格。他们在自己厂里质检时都合格(采用几种仪器检测都合格)，但送到地区药检所后，每次复检都不合格，后来经过认真研究后才发现是样品光解所致。　　如何判断被测试样有光解现象呢?这是年轻的分析工作者们感到棘手的问题。其实，这个问很好解决。根据作者的实践经验，首先要看规律，对同一个试样多次测量，看其吸光度值是否都是向同一个方向变化。如果在多次测试中，吸光度值从第一次到最后一次测试的数据都是一直在减小，或一直在增大，这就可能是光解现象所引起的，即试样可能有光解。如果不是向同一个方向变化，在多次测试中，吸光度值有时增大，有时减小，就可以肯定不是光解所致，应另找原因；其次，如果多次测试的数据是向同一个方向变化，这时，可将试样倒进比色皿中，放在仪器的比色皿架上，盖好样品室盖，作一次测试后，不要把试样取出来，而将样品室的光路用文献卡片挡住，待半小时后取去文献卡，再重复测试多次。如果试样没有光解特性，其测试的数据就不会有变化，如果试样有光解，测试的数据就会有变化。用这两种方法检查，如果每次重复测试的数据都有变化，则说明不是光解所致，而是其它原因使测试数据不稳定，这时分析测试工作者，应再找产生不稳定的其它原因。　　应该如何解决或避免光解的问题?一般也可以采用两种方法处理。其一，把试样存放在棕色瓶中，因为棕色瓶不透紫外光可以防止试样光解 其二，将存放试样的瓶子，用黑纸包住，也同样可防止试样光解。这两种方法，都可以有效的解决防止试样光解的问题。　　3、激光拉曼光谱[5]、[6]　　重视积分时间和降噪处理技术[6]是用好激光拉曼的关键之一：　　1)下图是不同积分时间下采集的滑石粉的原始谱图，激光波长为532.038nm,采集样品的激光功率均为10级(约为200mw)，平均次数均为1次，积分时间分别为50ms、500ms、1000ms、3000ms、5000ms。实测谱图如下：　　上图说明,认真选择积分时间非常重要，必须引起使用者的高度重视。　　2)下图是对滑石粉试样测试时，降噪处理前后测试结果的比对。　　上图说明降噪技术非常重要，必须引起使用者的高度重视。　　4、原子荧光和形态分析　　用好原子荧光和形态分析仪器需要使用者下苦功夫，因为它涉及到光谱(原子荧光)和色谱(HPLC)两种比较复杂的仪器。从仪器学理论和分析工作实际要求看，要用好原子荧光仪器和形态分析仪器，必须重视以下几个问题：　　(1)首先明确样品的基体， 如果样品基体特别简单,则在分析过程中各元素允许酸度范围内选择较低的酸浓度，这样有利于降低试剂空白,节约成本，减小对仪器的腐蚀；　　(2)如果分析元素的成份复杂，特别是含有对氢化反应构成干扰的元素Cu,Co,Ni等时，则适当增大样品酸度，有利于降低干扰。当然也可更换酸的种类，例如测定镍基合金中的Se,As等元素时，用酒石酸、柠檬酸等有机酸,可以使干扰元素的量明显改善。　　(3)还原剂问题，浓度、配制等，特别注意，还原剂必需在碱性溶液中配制。　　(4)如何用好HPLC，请读者参考作者2020年在仪器信息网上[7]的专文。此不赘述。　　5、有关问题的探讨　　1)只有重视仪器学理论[4]才能真正用好仪器　　什么是仪器学理论？它是一种综合性学科的理论。仪器学理论是一门涉及到多个领域的、复杂的、交叉的、边缘学科的理论，涉及到光学、机械学、电子学、计算机、应用等各个领域，特别是现代分析仪器，都离不开这些方面。　　仪器学理论是一切科学仪器研发者、生产者、使用者应该了解或掌握的最基本、最重要的理论之一。目前，很多仪器使用者，没有重视仪器学理论，往往出现数据不准确或发生疑虑时、分析数据与文献值或标准值不一致时，大家就不知所措！例如：当被测试的试样很稀或很浓时，分析误差会很大，但是中等浓度时，分析误差就正常。为什么？这个问题很多人不清楚。因为，从仪器学理论来讲，所有根据比耳定律设计的分析仪器，都只能适用于一定浓度。噪声N是限制被分析样品浓度下限的，根据仪器学的S/N理论：信号S一定，噪声N大，则仪器S/N就小、灵敏度就低，同时仪器的分析测试误差就会大。而杂散光S.L是限制被分析样品浓度上限的，试样很浓时，浓度与吸光度不成正比就偏离比耳定律，分析误差就会很大。如果有人用UVS检测0.0004Abs的样品，这是违背仪器学理论的。因为目前世界上最好的UVS之一的美国原Varian公司的Cary6000i，其基线平直度BF为±0.001Abs，它们的噪声都比0.0004Abs大很多倍，噪声把0.0004Abs的信号淹没了，根本不能检测0.0004Abs的样品。所以，仪器学理论像一把金钥匙，懂了一点仪器学理论，你才会一通百通，知其然也知其所以然。　　2)分析仪器制造者和使用者必须紧密结合　　分析仪器是给仪器分析工作者使用的，仪器分析工作者对分析仪器的要求是“好用”。所谓“好用”，就是分析仪器要稳定可靠；所谓稳定，就是漂移小、重复性好；所谓可靠，作者在30年前提出，应分为狭义和广义两种。狭义可靠性主要指分析仪器的故障率，它不能全面完整的表达可靠性的内涵。仪器故障不出，但是，分析测试的数据不准，这是最大的不可靠。所以作者提出了广义可靠性的定义：即指分析仪器的可靠性，主要指分析测试数据的准确度高、稳定性好、故障率低和售后服务好。因此，分析仪器的优劣，要在分析测试工作中检验，应由仪器分析工作者(使用者)来评价。分析仪器的好坏，必须要经过分析测试实际使用的检验后才能下结论。所以我们说，制造者是运动员，使用者是裁判员。由于许多分析仪器研发、制造工作者，不了解使用者在如何使用分析仪器、不了解使用者的思路和要求。结果，做仪器和用仪器的人脱节，互不沟通，做出的分析仪器有时不大好用，甚至不好用，这是造成我国分析仪器落后的主要原因之一。所以，分析仪器制造者如果离开使用者，就没有目标。分析仪器使用者如果脱离分析仪器制造者，不了解仪器的基本性能，就不可能用好分析仪器。同样，如果使用者不懂一点仪器知识，不了解仪器的性能指标与分析误差的关系、不会选择仪器条件，是肯定用不好仪器的。　　一台(或一种)新的分析仪器问世，必定是来自仪器分析工作的需要。许多分析仪器都来自应用实践的需求。如：八十年代中期，中科院上海有机化学研究所的知名有机化学家汪猷教授提出：他在核酸研究中发现，五种核苷中有的对UVS有吸收，有的对UVS没有吸收 有的有天然荧光，有的没有天然荧光。国外用HPLC分析测试时，往往用两种检测器(紫外、荧光)串连检测，这样，会使峰形扩散，降低灵敏度。当时，汪猷教授提出，能否研制一种紫外/荧光同时检测(记谱)的HPLC检测器？作者根据他的要求(实践需要)，在他的启发下，与他紧密结合，很快发明了一种紫外可见分光光度计和荧光光度计一体化设计、一机两用的多功能新型仪器。它作为HPLC检测器，只需要8微升样品，一次进样，就可得到试样的紫外和荧光两种信息。这种仪器大大减少了试样的扩散，具有很高的灵敏度，并且一次进样，可将五种核苷中的发荧光和不发荧光、有紫外吸收和没有紫外吸收的核苷区分开。该仪器1988年获得了国家发明奖，至今还未见国外报道过同类仪器。这就是分析仪器研发工作来自分析测试工作实际要求的一个很好的典型例子。我们的仪器研发人员应该重视研发仪器与使用仪器的关系。要走出去，向用户学习，从他们那里吸取营养、拓宽思路。　　还有，诺贝尔化学奖得主之一是日本岛津公司的田中耕一，他之所以能得诺贝尔化学奖，主要是他提出了“基体辅助激光解析质谱法”。这是一种对生物分子进行确认和结构分析的新方法。他用激光照射成团的生物大分子，成功的将生物大分子完整地相互分开，并电离，再用飞行时间质谱来测量。这一发明解决了世界上两大难题：第一，解决了成团的生物子结构和成份不受破坏地拆成单个分子的难题；第二，解决了用飞行时间质谱来测量分子量大到50-60万的生物大分子的难题。这一发明，使人类可以通过对蛋白质的详细分析，从而加深对生命进程的了解，使新药开发发生了革命性的变化，并在食品控制、癌症早期诊断等领域有广泛的应用！　　以上事实，足以说明仪器分析工作者(使用仪器者)与分析仪器工作者(生产仪器者)之间关系的重要性，更能说明分析仪器与仪器分析必须紧密结合、相互沟通、相互促进，这个问题，必须引起广大分析仪器工作者的极大关注。只有这样，才能保证研发分析仪器的人员能真正研发出可靠性好的、好用的分析仪器，才能保证使用者用好分析仪器。　　6、主要参考文献　　[1]李昌厚著，《原子吸收分光光度计仪器及其应用》，北京：科学出版社,2006　　[2]李昌厚著，《紫外可见分光光度计及其应用》，北京:化学工业出版社,2010。　　[3]李昌厚著，《紫外可见分光光度计》,北京:化学工业出版社,2005。　　[4]李昌厚著，《高效液相色谱仪器及其应用》，北京：科学出版社，2014。　　[5]李昌厚，便携式激光拉曼仪器及其应用的最新进展，仪器信息网，2019/7/11.　　[6]李昌厚著，《仪器学理论与实践》，北京：科学出版社,2008　　[7]李昌厚，用好HPLC的九大关键问题，仪器信息网，2020/2/26。　　[8]李昌厚，用好AAS的一些关键问题，仪器信息网，2020/8/17　　作者简介 李昌厚，男，中国科学院上海生物工程研究中心原仪器分析室主任、兼生命科学仪器及其应用研究室主任、教授、博士生导师、华东理工大学兼职教授，终身享受国务院政府特殊津贴。主要研究方向：长期从事分析仪器研究开发和分析仪器应用研究。主要从事光谱仪器(紫外吸收光谱、原子吸收光谱、旋光光谱、分子荧光光谱、原子荧光、拉曼光谱等)、色谱仪器(液相色谱、气相色谱等)及其应用研究，特别对《仪器学理论》等有精深研究。以第一完成者身份，完成科研成果15项。由中科院组织专家鉴定，其中13项达到鉴定时国际上同类仪器的先进水平，2项填补国内空白 以第一完成者身份获得国家级和省部级科技成果奖5项(含国家发明奖1项) 发表论文183篇，出版专著5本 现任中国仪器仪表学会理事、《生命科学仪器》副主编 曾任中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届、第六届副理事长，国家认监委计量认证/审查认可国家级常任评审员，国家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大仪器及其应用专项的技术专家组组长或成员，上海市科学仪器专家组成员，《光学仪器》副主编，《光谱仪器与分析》副主编，上海化工研究院院士专家工作站成员等十多个学术团体和专家委员会成员等职务。

结论分析工作者在药物的有关物质高效液相色谱法的方法开发和检查，应对检验过程中出现的杂质峰予以重视，以免出现误判。结果易被误认为是有关物质的峰包括溶剂峰、有机酸盐峰、无机酸盐峰和辅料峰，本次将举例说明并对这些峰的形成原因进行简单分析。根据药品注册的国际技术要求中杂质的含义，杂质分为有机杂质、无机杂质和残留溶剂。有关物质是杂质的一种，主要是指有机杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料药前体、中间体、试剂、分解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物。有关物质的检查方法很多，主要有薄层色谱法、高效液相色谱法（HPLC法）、气相色谱法和紫外分光光度法等。其中，HPLC法由于分离效果好、专属性强、灵敏度高，在有关物质检查中最为常用。在采用HPLC法对药物进行有关物质分析时，一般要求考察最大杂质峰面积或各杂质峰面积的和，将其与对照溶液的主峰面积（主成分自身对照品法）或总峰面积（面积归一化法）比较，规定应不超过某一特定的数值。但在实际检验过程中，排除配样引进或者是柱子没冲干净这些因素外，色谱图上仍然会出现保留时间较弱的峰，易被误认为是杂质峰，从而造成结果的误判。笔者结合日常检验工作和相关文献，选取了几个具有代表性的品种，将这些易被误认为是杂质峰的峰归纳为溶剂峰、有机酸盐峰、无机酸盐峰和辅料峰，并对这些峰的形成原因进行分析，以期对药物的有关物质HPLC方法的研究和常规检查提供参考。1. 溶剂峰在HPLC法中，由于溶解对照品或供试品的溶剂和流动相在某一波长的吸光值不一样，因此产生了吸光值的变化，表现为出现溶剂峰。溶剂峰可能是正常形状的峰，也可能是倒峰，还有可能是一组奇形怪状的峰。减小该类溶剂峰最有效的方法是使用流动相作为溶剂溶解样品，这样既可以避免样品溶剂和流动相之间任何强度或黏度的不匹配，也可以减少样品分析时基线的漂移。此外，值得注意的是，在进行有关物质分析时，要等基线平稳后，再进空白溶剂。一般进样2次，计算供试品溶液的杂质峰时，溶剂峰位置的峰是不参与计算的。2. 有机酸盐峰《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版（二部）采用HPLC法对苯磺酸氨氯地平的有关物质Ⅱ进行控制。以甲醇-乙腈-0.7%三乙胺溶液（取三乙胺7.0 mL，加水至1000 mL，用磷酸调节pH值至3.0±0.1）（35:15:50）为流动相，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，检测波长为237nm。标准规定：氨氯地平杂质I峰的峰面积乘以2与其他各杂质峰面积的和应不得大于对照溶液主峰面积的（0.3%）。实际检测时，氨氯地平的出峰时间为17.5min，但是在溶剂峰出峰的位置有响应较高的峰（保留时间3.0min），色谱图见下图。若将该峰判定为杂质峰，则会出现有关物质超标的情况。将苯磺酸配制成一定浓度进样后最终确定该峰为苯磺酸的峰。也有研究采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用对苯磺酸的出峰予以确证。苯磺酸为一元有机酸，其pKa为0.7，在通常的流动相pH范围内，苯磺酸氨氯地平主要解离为氨氯地平阳离子（被质子化）和苯磺酸阴离子（C6H5SO3-），因此，苯磺酸氨氯地平会出现两个峰，一个是苯磺酸（保留时间较短），一个是氨氯地平。同时，研究表明，采用反相HPLC法同时测定复方感冒药中的多种成分时，对马来酸氯苯那敏色谱峰的识别易出现判断错误，将马来酸的峰误认为是马来酸氯苯那敏。马来酸为二元有机酸，其pKa分别为2.00和6.26，在通常的流动相pH范围内，马来酸氯苯那敏主要解离为氯苯那敏阳离子（被质子化）和马来酸阴离子（HOOCCH=CHCOO-），因此，马来酸氯苯那敏也会出现两个峰。在色谱系统开发过程中，一般会调节流动相pH，与目标化合物pKa相差2个单位以上，使药物全部解离或结合，这样才能准确定量。对于带有机酸根的化合物的液相检测，比如马来酸氯苯那敏、富马酸喹硫平、苯磺酸氨氯地平，在选择的流动相pH条件下，若目标化合物以离子型存在，则马来酸、苯磺酸和富马酸等有机酸也会以盐的形式存在，这些有机酸因含有共轭结构均有紫外吸收，从而在液相条件下也会出现一个色谱峰。因此，做此类物质的有关物质和含量测定时就应注意，不应将有机酸的峰误认为是杂质峰，或者是将有机酸的峰误认为是目标化合物的峰，造成结果的误判。3.无机酸盐峰《中国药品标准》采用HPLC法检测盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的有关物质。以硫酸铜D-苯丙氨酸溶液（取D-苯丙氨酸1.32g与硫酸铜1g，加水1000mL溶解后，用氢氧化钠试液调节pH值至3.5）-甲醇（82:18）为流动相，检测波长为293nm。标准规定，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积。实际分析时，在3.3min出现一个很大的峰，色谱图见下图 。经过分析，认为与盐酸稀释后进样的峰位相同，因而在计算有关物质时不应将该峰误认为是杂质峰。笔者在参与针对新版药典用的氢溴酸右美沙芬化学对照品的标化工作中，参照《中国药典》 中氢溴酸右美沙芬胶囊含量测定的方法，对氢溴酸右美沙芬进行有关物质检查，流动相为乙腈－磷酸盐缓冲液（取磷酸和三乙胺各5mL，加水至1000mL）（28:72），检测波长220nm，实际检测时发现在2.5min出了一个很大的色谱峰。为了验证该峰，用溴水稀释后直接进样分析，结果在同样位置出峰。见下图。因此，在结果判定时，应注意不要误将该峰归纳入杂质峰。类似于含有有机酸的药物，含有无机酸的药物在通常的流动相pH条件下也均会发生解离，以盐形式存在的化合物进入液相系统后会以游离碱的形式存在，盐酸和氢溴酸是强酸，也在流动相里解离形成氯离子和溴离子。在对不同水中氯离子含量的比对分析中，用1cm的石英比色皿，取一定浓度的氯化钠标准溶液作为待测液，采用紫外-可见分光光度计，扫描范围280~350nm，确定了氯离子在波长为308.7nm左右处有最大吸收。研究也验证了溴离子在200~220nm波长范围内有较强的紫外吸收。分析原因，可能是氯离子和溴离子有8电子的稳定结构而导致紫外吸收，具体原因还有待进一步分析。

喹诺酮类(4-quinolones)抗生素，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药，主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱（某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用）。抗生素分析一直是CAPCELL PAK系列色谱柱擅长的领域，随着DAISOPAK系列色谱柱的上市，用户希望能更加全面的了解DP色谱柱的分离特点。借诺氟沙星的对比实验结果，切实对比一下CP MGII和DP ODS-P色谱柱在诺氟沙星分析上的分离效果。按照20版药典诺氟沙星含量测定和有关物质项下方法，分别使用CP C18 MGII和DP ODS-P色谱柱对系统适用性溶液进行了分析。CAPCELL PAK C18 MGII 色谱柱分析结果使用CAPCELL PAK C18 MGII S5 4.6mm i.d.×250mm色谱柱含量测定分析结果如图1所示。系统适用性溶液分析结果中，调整流速为1.3 mL/min后，诺氟沙星保留时间9.4 min，理论塔板数13238，与依诺沙星分离度4.91，与环丙沙星分离度3.85，均能够满足药典主峰保留时间约为9 min，且分离度大于2的要求。图1 含量测定分析结果(MGII)图上所示数字从下到上为分离度、保留时间、理论塔板数【色谱条件】色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGII S5 4.6×250流动相：0.025 mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0±0.1）/ 乙腈 = 87 / 13流动速：1.3 mL/min温动度：35 °C检动测：PDA 278 nm浓动度： 系统适用性溶液：每1 mL中含诺氟沙星25 µ g、环丙沙星和依诺沙星各5 µ g （流动相）进样量：20 µ L有关物质分析结果如图2-图4所示，系统适用性溶液色谱图（278 nm）中，诺氟沙星峰的保留时间为9.3 min，与依诺沙星和环丙沙星分离度分别为3.81和3.49，能够满足药典主峰保留时间约为9 min，且分离度大于2的要求。图2 有关物质分析结果(278 nm)图3 局部放大图(278 nm)图上所示数字从下到上为分离度、保留时间、理论塔板数图4 有关物质分析结果(262 nm)【色谱条件】色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGII S5 4.6×250流动相：A: 0.025 mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0±0.1）/ 乙腈 = 87 / 13 ；B: 乙腈流动相：B% 0%(0 min)-0%(10 min)-50%(20 min)-50%(30 min)-0%(32 min)-0%(42 min)流动速：1.3 mL/min温动度：35 °C检动测：PDA 278、262 nm浓动度： 系统适用性溶液：每1 mL中含诺氟沙星0.15 mg、环丙沙星和依诺沙星各3 µ g进样量：20 µ LDAISOPAK SP-100-5-ODS-P 色谱柱分析结果由于ODS-P系列色谱柱保留更强，为满足药典中主峰保留时间约为9 min的要求，选用了柱长150 mm的色谱柱，且与CP C18 MGII相比选用了更低的流速。使用DAISOPAK SP-100-5-ODS-P S5 4.6mm i.d.×150mm色谱柱含量测定分析结果如图5所示。系统适用性溶液分析结果中，诺氟沙星保留时间9.4 min，理论塔板数9963，与依诺沙星分离度4.24，与环丙沙星分离度3.81，均能够满足药典主峰保留时间约为9 min，且分离度大于2的要求。图5 含量测定分析结果图上所示数字从下到上为分离度、保留时间、理论塔板数【色谱条件】色谱柱：DAISOPAK SP-100-5-ODS-P S5 4.6×150流动相：0.025 mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0±0.1）/ 乙腈 = 87 /13流动速：1.0 mL/min温动度：35 °C检动测：PDA 278 nm浓动度： 系统适用性溶液：每1 mL中含诺氟沙星25 µ g、环丙沙星和依诺沙星各5 µ g进样量：20 µ L有关物质分析结果如图6-图8所示，系统适用性溶液色谱图（278 nm）中，诺氟沙星峰的保留时间为9.2 min，与依诺沙星和环丙沙星分离度分别为2.64和3.17，能够满足药典主峰保留时间约为9 min，且分离度大于2的要求。图6 有关物质分析结果(278 nm)图7 局部放大图(278 nm)图上所示数字从下到上为分离度、保留时间、理论塔板数图8 有关物质分析结果(262 nm)【色谱条件】色谱柱：DAISOPAK SP-100-5-ODS-P S5 4.6×150流动相：A: 0.025 mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0±0.1）/ 乙腈 = 87 / 13 ；B: 乙腈流动相：B% 0%(0 min)-0%(10 min)-50%(20 min)-50%(30 min)-0%(32 min)-0%(42 min)流动速：1.0 mL/min温动度：35 °C检动测：PDA 278、262 nm浓动度： 系统适用性溶液：每1 mL中含诺氟沙星0.15 mg、环丙沙星和依诺沙星各3 µ g进样量：20 µ L结论使用CAPCELL PAK C18 MGII以及DAISOPAK SP-100-5-ODS-P色谱柱均可在药典条件下，实现诺氟沙星有关物质以及含量测定分析，理论塔板数高，峰型良好，分离度符合药典要求。相较CAPCELL PAK C18 MGII色谱柱，SP-100-5-ODS-P色谱柱的保留能力更强，在相同流动相下可使用更短的色谱柱和更低的流速达到相同的保留强度，但随着柱长的降低，理论塔板数和分离度同步略有降低。2020年版《中华人民共和国药典》诺氟沙星含量测定和有关物质项下方法推荐用柱F92533 CP C18 MGII S5 4.6×250DP957047 SP-100-5-ODS-P 4.6×150