研究方法优化

2011年11月29日-12月1日，中国环境监测总站在重庆市组织召开了“十一五”水专项“地表水环境质量特定监测项目分析测试方法优化研究”子课题结题准备会。中国环境监测总站王业耀副站长、河南省环境监测中心徐广华站长、重庆市环境监测中心罗财红副站长出席会议，中国环境监测总站、河南省环境监测中心、重庆市环境监测中心等子课题承担单位相关研究人员参加了会议。 　　会议由中国环境监测总站滕恩江主任主持。水专项项目管理组王光介绍了课题结题的相关要求，子课题负责人吕怡兵汇报了总体研究进展情况及取得的成果，子课题参加人员汇报了各自承担项目的研究情况，并就监测技术与方法、实验技术与方法进行了广泛的交流和讨论。与会领导听取了子课题进展情况的汇报，认为子课题按照要求已基本完成考核指标，可以准备结题，为使研究工作更加完善，子课题参加人员还应进行如下研究：①补充实际样品的测定实验。②进一步凝练研究成果。

新药研发过程中的分析方法开发是一个耗时费力的过程。原因是在这个过程中，我们需要耗费大量的重复劳动和人力，用于确定和优化正确的分析条件和技术参数。为了解决这些问题，研究人员需要使用多种不同的技术和平台。珀金埃尔默建立一个一站式、全自动化配置优化的平台——JANUS® G3分析方法开发工作站平台，该系统基于均相时间分辨荧光技术（HTRF® ）的蛋白质间相互作用（PPI）的检测和分析，且提供了⼀种便捷⾼效、⾼阳性率的单克隆抗体阳性克隆筛选方法，助力新药研发过程的高效优化。平台配置如下图1。图1：JANUS® G3分析方法开发工作站平台1扩展台面，支持复杂实验流程的微孔板制备2微孔板振荡功能，保证孔板里液体的高效混合3VICTOR® Nivo™ 微孔板检测仪，可读取分析数据4整合型机械抓手，可实现微孔板和其他实验耗材的抓取，并在工作站台面及VICTOR® Nivo™ 微孔板检测仪间自动转移5VariSpan™ 移液机械臂，可通过独立的通道液面检测精准地制备出微孔板什么是HTRF?均相时间分辨荧光（HTRF, Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）是⽤来检测纯液相体系中待测物的⼀种常⽤⽅法。它提供了一种简单、免洗的方法，可在短短两个小时内检出靶蛋白并对其进行量化分析。它将荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨测量的优点相结合，可消除短暂的背景荧光，成为分析方法学开发应用中的理想选择。在FRET实验中，生物分子（如蛋白等）被荧光基团供受体标记。当生物分子之间相互作用，供受体荧光基团的距离被拉近。此时，若供体被激发，它会传递它的发射光能量给受体。受体和供体的发射光具有不同的波长，可以被微孔板读板机区分，从而定量生物分子之间的相互作用。使用镧系元素荧光基团作为供体，发射光有很长的半衰期，HTRF可以利用时间分辨检测荧光，消除短半衰期背景荧光的干扰。在HTRF实验中，由于供体荧光基团发射光有较长半衰期，供受体荧光基团的激发和发射都可以在短半衰期背景荧光消失后再检测。典型的HTRF检测把铕穴状化合物用作供体，有机荧光团d2用作受体(技术原理如下图2)。图2：均相时间分辨荧光 (HTRF)原理图HTRF的优势?与传统检测技术相比, HTRF检测的主要优点：1灵敏度高，实验通量高2步骤简单，无需包被和洗板，无需避光，适用于贴壁细胞和悬浮细胞，只需将细胞进行刺激→裂解→加检测试剂→读板；（无需洗板机，不需要加热和避光孵育塔，成本降低，自动化程度高，Perkin Elmer提供一站式解决方案）3降低背景和提高信噪比，提高灵敏度，数据真实可靠4支持96或384孔板至更高通量分析检测5实验体系稳定，可耐受较宽的pH范围、二价金属离子、螯合物等，并可在48小时内反复多次检测HTRF的应用？检测可分析生物化学过程中的分子相互作用，被广泛用于研究激酶、细胞信号转导通路、蛋白相互作用PPI（protein-protein interaction）、DNA与蛋白的相互作用、细胞毒性以及受体与配体的结合。其中供体和受体可以被用于标记各种生物分子，应用范围包括表观遗传学，生物标志物定量，GPCR信号转导等。特别，该检测技术支持强大的混合-读数模式，无需进行任何清洗步骤。这一优点连同实验的稳定性，使该技术非常适用于自动化和筛选类应用。珀金埃尔默JANUS® G3分析方法开发工作站平台助力新药研发该平台基于均相时间分辨荧光技术(HTRF)。采用了TIBCO

湿法造粒是口服固体制剂生产经常采用的加工工艺，目标是将通常细而粘的活性成分和辅料加工成更均匀、自由流动的颗粒，方便下游加工。 具有理想特性的颗粒可以有效改善加工性能，包括提高生产量，赋予片剂所需的关键属性等。但是，这意味着湿法造粒制成的粒子通常只是半成品，而非最终产品，从而产生了一个问题，即：如何控制造粒工艺，获得最终能生产出良好片剂的粒子？在第一种情况下，有必要确定潮湿颗粒可测定的参数，以便用来量化粒子属性的差异。 本文描述了全球粉末表征技术领先企业富瑞曼科技和制药加工解决方案主要供应商GEA Group（基伊埃集团）公司双方进行的联合实验研究。本实验采用了基伊埃的ConsiGma? 1连续高剪切湿法造粒及干燥系统，用于造粒，并运用富瑞曼科技的FT4粉末流变仪?进行动态粉体测试。所获得的结果显示了如何根据动态测定潮湿颗粒的结果，来预测成品片剂的属性。研究结果突出表明，动态粉体测试作为一种有价值的工具，可用于加速优化湿法造粒工艺、改善对加工的认识和控制，并对连续加工方法的开发提供支持。湿法造粒的目的和挑战 湿法造粒通常用来改善压片混合工艺的特性，使得粒子在压片过程中拥有优化的加工属性，赋予片剂所需的优点。目的是形成均匀的颗粒，提高压片产量，并使片剂拥有所需的关键品质属性，如重量、硬度以及崩解性能等。 在湿法造粒时，配混料的活性成分、辅料组份和水混合在一起，形成均匀的颗粒。然后，这些均聚体或者粒子得到干燥、研磨、润滑等进一步加工，形成压片机所需的理想喂入材料。这些喂入材料的特性可以通过调节各种加工参数，包括水的含量、粉末喂入速度、螺杆速度等有可能产生影响的造粒等环节来进行控制。通过调节一个或者更多的变量，调节粒子属性，确保粒子在压片机中处于理想的性能状态。 但是，要生产出具有规定属性的粒子，需要认识这些关键的加工参数会对粒子产生何种影响，同时还必须认识粒子属性和最终片剂之间的关系。通过以下实验，可以看出动态粉末测试将如何帮助实现这些目标。动态粉末测试概述 动态粉末测试是对运动中的粉体而非静态粉体进行测量， 并直接测定了松体的流动特性，这有助于在非常接近真实加工环境的状态下对粉体进行表征。可以测得经混合、处于低应力状态、充气甚至呈流体状态下粉体样本的动态特性，以精确模拟加工环境，获得给定工艺条件下直接相关的数据。 当刀片沿着规定路径旋转通过粉体样本时，测量作用于刀片上的扭矩及力，以衡量动态粉末特性。当刀片向下穿过样本时，测得基本流动能（BFE）。它反映了粉体穿过挤出机或喂料机时，在受力状态下的流动特性。比能（SE）测量的则是刀片向上运动时粉体的特性，直接反映了低压环境下，如粉体在重力状态下自由流经模具时的行为特征。加工参数对湿法造粒粒子特性影响的研究 富瑞曼科技和基伊埃集团进行了一项研究，用以确定湿法造粒粒子的动态流动特性是否与片剂的硬度的特性相关。通常情况下，片剂硬度对片剂质量起关键作用。试验采用了基于ConsiGma 25连续高剪切粒子和干燥原理的实验室设备ConsiGma1。 这套系统包含具有专利的连续高剪切造粒及干燥机，可以加工几十克至五公斤、甚至更多的样本。 在该系统上进行的研究有利于促进高效的产品和工艺开发，系统停留时间少于30秒。用ConsiGma1生产的潮湿、干燥的粒子由FT4粉体流变仪进行了表征。 实验项目的第一阶段，对不同造粒条件，如不同含水率、粉体喂入速度和造粒机螺杆速度等状态下的粒子属性进行了评估测试，测试的是基于乙酰氨基酚（APAP）及磷酸氢钙(磷酸二钙)这两种粉体配方的模型。系统地改变了加工参数，并测量了所得到的潮湿粒子的BFE。图2显示的是以不同螺杆速率生产出来的APAP配方粒子的BFE随含水量变化的关系。 收集到的APAP配方数据显示，如果螺杆速度保持不变，则随着含水量增加，BFE也升高。当含水率相同时，低螺杆速度同时会产生高BFE的粒子。两种趋势都会出现，因为高含水量、低螺杆速度，造成喂料多，可能生产出更大、密度更高、粘结性更强、对刀片运动阻力相对更高的粒子。数据同样显示，当含水率为11%、 螺杆速度为600rpm时，所生产的粒子的BFE与采用螺杆速度为450rpm、含水率为8%的粒子的BFE相当。这项发现非常重要，因为它表示，具有相似特性的粒子可以采用不同加工条件获得。 图3显示，含水量和螺杆速度分别保持15%和 600rpm不变，当干燥粉末喂入造粒机的速度降低时，DCP配方制成的粒子的BFE显著增加。 其它数据表明，可以通过降低喂入速率，以更低的含水率得到相同BFE的粒子。如，含水15%、螺杆速度约为 18kg/小时的粒子的特性与含水25%、喂入速度为25kg/小时的粒子相近。结合APAP配混料的研究，结果显示，可以通过加工条件的不同组合来得到具有相同特性的特定粉体。 表1列出了，生产具有不同属性的两组粒子所采用的不同工艺参数。条件1和条件2获得的潮湿颗粒的BFE值约为2200mJ，而条件3和条件4获得的BFE值约为3200mJ。 在下列加工工艺，包括干燥、研磨、润滑等阶段的每一步都测量了粒子的BFE，以改善加工性能。本研究中所采用的流动助剂是硬脂酸镁。在所有这些阶段，不同组的相对BFE值保持不变，第3、4组的BFE值一直高于1、2。 图4模拟了加工过程每一阶段的粒子流动特性。条件3和4显示，干燥后的BFE值有所上升，因为，与条件1和2状态下的粒子相比，条件3和4状态下的粒子相对尺寸大、密度高、机械强度高。 研磨后，尽管粒子密度、形状和韧度差异依然存在，但尺寸更为接近。这也使得BFE的观察结果显得有理可据。这些差别在润滑后保持不变，状态1、2和3、4之间的差别明显。 这些结果清楚表明，可以在各种不同的加工条件下，加工出用BFE衡量的、具有特定流动特性的粒子。这些测试显示，BFE值可用于湿法造粒加工产品和工艺的开发， 但同时也会产生问题，即BFE值是否可以进一步用以预测压片机内的粒子行为，以及，更重要的是，BFE是否可以与片剂关键品质属性直接相关。在粒子动态特性与片剂质量之间建立相关性 采用相同的工艺参数，在压片机中对四批潮湿粒子进行了干燥、研磨、润滑。然后测量了片剂的硬度。图5 为片剂硬度与不同阶段粒子流动性的关系。 结果显示，BFE和片剂的硬度与湿态和干燥的粒子有关，而且与它们的变化极其有关。与潮湿粒子和润滑粒子有关是比较容易理解的。尽管两者的相关性不如它与干燥、研磨过的粒子来得明显。所观察到的润滑过的粒子之间差异性和相关性差应归因于硬脂酸镁的整体影响。 这个数据综合反映了粒子在不同加工阶段的流动性（用BFE进行表征）与最终粒子关键质量属性（此处指硬度）之间存在的直接关系。这意味着，一旦特定的BFE与更理想的片剂硬度相关，就可用于推动对湿法造粒工艺进行的优化。结果表明，假如潮湿粒子能够获得目标BFE，最终以硬度衡量的片剂质量就可得到保障。这为提高产品和工艺开发效率，并且，不管是分批还是连续造粒工艺，都能获得更好的工艺控制路径，创造了机会。面向未来今天，采用传统的批次加工方法依然占支配地位，但业内很多人预期，未来大量的产品会采用连续加工。本文中，富瑞曼科技和基伊埃集团共同为将这一理想变成现实向前迈进了一大步。文章揭示了通过采用不同的工艺条件，有望获得特定的片剂属性，并且指出，动态粉末特性如流动性与最终产品的特性直接相关。 本文最初于2014年3月刊登于《医药制造》杂志。结束 图 图1：FT4粉末流变仪?的基本工作原理。测量刀片（或叶片）在穿过样本时遭遇的阻力，量化所测量粒子或粉末松体的流动特性。图2：为APAP配方制备的粒子的BEF随着含水量的增加以及螺杆速度的下降而增加。图3：为DCP配方制备的粒子的BFE随着喂入速率的下降而显著上升。图4：在造粒的不同阶段BFE变化明显，但不同组的粒子之间会存在明显差异。Figure 5: A strong correlation is found between the BFE of the granules and final tablet hardness图5：粒子BFE和最终片剂硬度之间存在很强的关联度Table 1: Four different processing conditions used to make two distinct groups of granules表1：两组明显不同的粒子采用的4种不同加工条件