形态差异

导读 对于从事砷元素形态和汞元素形态分析的小伙伴们来说，更换色谱柱更换流动相是一项令人烦躁的存在，总想一劳永逸。然而，砷元素和汞元素化学形态多、性质差异大，通常需要独立的分离条件才能实现各自准确的定量。定量两个元素多种形态，耗费时间长，仪器运行成本高，员工期盼下班早，有没有解决办法呢？这里有锦囊妙计与您分享。汞好极性攀比，砷喜离子交换自然界中常见的砷形态有亚砷酸（As（Ⅲ））、砷酸（As（Ⅴ））、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、砷甜菜碱（AsB）和砷胆碱（AsC）等；常见的汞形态有无机汞(iHg)、甲基汞(MeHg)和乙基汞(EtHg)。对于以上6种形态砷和3种形态汞的定量来说，HPLC-ICPMS联用是常用的分析方法，其中，LC的分离条件是关键。在现有的法规标准和文献资料里，无机汞、甲基汞和乙基汞由于具有比较明显的极性差异，分离方法多选用反相色谱原理为依据；6种形态砷由于具有一定的离子特性，以离子交换的方式来实现对它们的分离是常用的手段。以《中国药典2020版》第四部通则2322为例，形态汞分离选用的是C18柱，而形态砷分离选用的是阴离子交换色谱柱。实验希望降成本，人员期盼提效率受限于形态砷和形态汞的液相色谱分离通常需要不同的色谱柱和不同的流动相，当需要定量分析两种元素的形态时，往往需要分别测试。抛开色谱柱的消耗更换以及流动相的区别配制不说，实验耗费时间常常是最受每一位实验人员关注的，既影响了仪器运行成本，也降低了分析效率。质谱定量原省气，液相分离更省时如果在HPLC的分离部分能够实现同时对6种形态砷和3种形态汞的分离，那么分析效率和运行成本将会得到有效改善。方案选用岛津LC-20Ai高效液相色谱仪和ICPMS-2030系列电感耦合等离子体质谱仪联用系统。2017年 AnTop智能化节能ICPMS开创者奖的获得者，岛津公司ICPMS-2030系列电感耦合等离子体质谱产品通过快速匹配的高频发生器降低对氩气纯度要求、Mini炬管减少工作时氩气的流量消耗以及ECO模式待机时更低的功率和氩气损耗，综合可实现降低70%的使用成本。① 超低氩气消耗运行；② 全惰性液相系统；③ 集成软件同时实现对LC和ICPMS的控制• HPLC分离条件：形态砷、汞共用一根色谱柱，相同的流动相，在等度洗脱的条件下实现分离。HPLC分离时间10min。表1. HPLC 分析条件• ICP-MS定量条件：在总氩气消耗量为9.80L/min条件下稳定运行Mini炬管示意图您要的图我没忘，定量结果这也有元素形态的分离是大家关心的永恒问题，让我们一起看看6种形态砷和3种形态汞在一针进样的条件下分离情况如何吧：形态砷和形态汞混合标准溶液色谱图1. 砷胆碱（AsC） 2. 砷甜菜碱（AsB）3. 亚砷酸（As（Ⅲ）） 4. 无机汞(iHg)5. 二甲基砷酸（DMA） 6. 甲基汞(MeHg)7. 一甲基砷酸（MMA） 8. 乙基汞(EtHg)9. 砷酸（As（Ⅴ））基于反相色谱原理我们使用HPLC同时分离了6种形态砷和3种形态汞，使用ICPMS-2030系列测定了地表水中的6种形态砷和3种形态汞的含量，并进行加标回收率实验。表2. 环境地表水样品分析结果注：N.D.表示未检出写在最后在探索中前进，从客户需求出发。困扰您的费时费力问题，也许，联系我们，您就可以豁然开朗。形态砷与形态汞，您可以同时测定。撰稿人：钟跃汉本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

自然环境中砷（As）、铬（Cr）、硒（Se）存在多种化学形态，在不同环境条件下，氧化还原行为存在差异，不同形态对环境和健康影响不同。传统的元素总量分析不能提供足够的信息去了解元素的存在形态，而不同元素形态存在物理、化学、生物活性差异，并与其毒性、生物可利用性、迁移性密切相关。 砷、铬、硒常见形态/价态见表1，其中无机砷（三价砷和五价砷）毒性远大于有机砷，三价铬（Cr Ⅲ）和硒是人体必需的营养元素，人体内过量的硒会导致疾病，六价铬（Cr Ⅵ）则具有致癌毒性。 表1 砷、铬、硒形态/价态 有机砷和有机硒主要是生物吸收砷、硒无机形态后转化而来。在地表水和生活饮用水中砷、硒主要以无机形态存在，六价铬是地表水、地下水和生活饮用水常规控制指标。水中的砷、铬、硒形态分析对于环境质量评价、生态效应和人体健康具有重要意义。 岛津方案 高效液相色谱（HPLC）技术作为高效的分离技术，在元素形态分析中得到广泛应用，与高灵敏度的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）联用，使HPLC-ICP-MS成为砷、铬、硒、汞等元素形态分析的主要方法。但是，不同元素形态分析通常使用不同的分离原理和流动相，分离时间较长，需要多次、长时间才能完成一个样品中砷、铬、硒形态的测试。基于以上因素，我们利用岛津LC-20Ai+ICPMS-2030系列联用系统开发了一种同时分离地表水中砷、铬、硒无机形态的方法。 图1 岛津LC-20Ai+ICPMS-2030系列联用系统 • 方法学使用岛津惰性液相色谱仪LC-20Ai，以C8色谱柱对砷、铬、硒元素无机形态进行分离，流动相为含2 mM四丁基氢氧化铵（TBAH）和0.5 mM乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）的5%甲醇水溶液，以氨水和硝酸调节pH为7.4，分析条件见表2、3。 表2 液相色谱LC-20Ai条件表3 ICPMS-2030系列测试条件在3 min内实现砷、铬、硒无机形态的快速分离，分离度良好。 图2 砷、铬、硒色谱图（单位kcps） • 水样分析结果某河水和生活饮用水样本分析结果见表4，如表中结果所示，砷、铬、硒无机形态加标回收率为91.5~112%。 表4 某河水和生活饮用水样本测试结果备注：N.D.-未检出 结语水是生命之源，为环境保护提供分析解决方案是岛津的使命所在。一针进样，3 min知晓地表水、饮用水中无机砷、铬、硒形态含量，助力水环境研究和水资源安全，共同守护绿水青山。

历史总是裹挟着泥沙咆哮在纷繁的世间把真相搅得混乱，真相就在泥沙俱下的潮流中左右飘摇，沾染了人的情感后沦落为主观的历史，生活如此，科学亦如此！还好“造物主”为了使通往真理的道路不那么拥堵，选择让大部分人保持无知。这种无知保护了真相安静地立在圣洁的角落窥视这戏剧的凡尘消长浮沉。 不知从什么时候开始，无论哪个领域，凡是国人创造出异于国际的新鲜事物，都被冠以“中国特色”的名号，在那个特殊的年代“中国特色”作为一个中性词而被国人贴上了激进的标签，这无疑是个引以为傲的字眼，而近些年又是在不同的历史环境下这个字眼显得格外刺眼，很多语境下略带几分嘲讽的意味。“中国特色”、“中国制造”到底怎么了？这不应该是“穷矮搓”的代名词。今天小编不想论证什么，只是想通过讲述一台国产实验室分析仪器的前世今生，为“中国制造”发声。 在整个实验室仪器界，气态氢化物发生法原子荧光光谱仪是为数不多的具有中国自主知识产权的实验室分析仪器，可以说到目前为止原子荧光光谱仪是唯一一款可以为国产实验室分析仪器代言的大型实验室分析设备。商品化原子荧光光谱仪的诞生有其特殊的历史原因，在特定的历史环境下，这是上世纪第一代仪器人共同努力的结果。虽然那些曾经参与研发的老一辈科学家都已迟暮，有的甚至早已离我们而去，但这些前辈的研发轶事至今还被业内的后人津津乐道。而新世纪下，在这种仪器基础上发展起来的液相色谱与原子荧光联用仪既形态分析仪有着怎样的研发历程，恐怕听闻者甚少。 事情要从本世纪初说起，随着现代科学技术的迅猛发展，科技工作者发现，一种元素的生理毒理特性、生物利用度、环境行为和迁移性在很大程度上取决于它的形态，形态间差异造成了这些特性截然不同。这样仅测定体系中元素的总量已不能满足科学家们在生物、环保、临床医学、毒理学等各个研究领域的需要，研究人员迫切地需要知道元素在样品内的实际状态以及化学活性、生物活性和毒性等重要信息。以砷为例，在自然界，砷元素可以以许多不同形态的化合物存在，在空气、土壤、沉积物和水中发现的主要砷化物有三氧化二砷或亚砷酸盐(As(III))、砷酸盐(As(V))、一甲基砷酸(MMA)和二甲基砷酸(DMA)；在海产品中则主要以砷甜菜碱(AsB)和砷胆碱(AsC)形式存在。另外，还有其他更复杂的砷化合物，例如砷糖(Arsenosugars)、砷脂类化合物等。不同形态的砷其毒性相差很大，如砷的无机化合物一般具有毒性，无机三价砷As(III)能与带巯基（SH）的酶生成稳定的螯合物，使得很多的酶活性降低或消失，严重干扰细胞的生物功能、结构和正常代谢；而有机砷的毒性一般比无机砷小得多，有些形态甚至几乎无毒，像一些海产品中，虽然总砷含量较高，但绝大部分都是以砷糖、砷甜菜碱等无毒形态存在，因此人吃了后并不会引起砷中毒。 那时国际上早有研究者在研究用于形态分析的各种方法，其中以冷阱法和色谱法的研究最为热门，并且均有相应的产品上市。在贸易市场方面，检测手段的落后，使得国际社会的进口标准对中国部分水产品的出口形成强大的贸易壁垒，国内出口贸易受损事件屡见不鲜。针对这些情况，清华大学张新荣教授团队率先开始着手研究液相色谱与原子光谱联用技术，用以解决样品检测中元素形态分析的难题。北京吉天仪器有限公司再得知此消息后，立即联系该研究团队，并将一台当时生产的AFS-820型原子荧光光谱仪送到张教授实验室，进行联用试验。经过一段时间的摸索，基本攻克了液相色谱与原子荧光联用接口技术的难题，2004年吉天公司开始正式上马形态分析仪项目，组建以刘霁欣博士牵头的研发队伍，欲将这种仪器商品化。经过反复的硬件调试和方法开发，于2005年10月正式推出SA-10型形态分析仪，同年被仪器信息网评为“2004-2005年仪器新产品”。至此，又一完全具有中国自主知识产权的“中国特色”形态分析仪正式登上历史舞台。不久这一仪器就在全国范围内得到实际应用，其中2006年12月12日的《科学时报》、2006年第6期《现代科学仪器》和2006年12月26日的《仪器信息网》分别报道了《北京吉天色光联用仪纠正“紫菜”错案》的信息。此时，针对这一新型仪器，吉天的应用工程师通过大量实验摸索已经开发和优化出诸多样品如海产品、饲料，血、尿等的前处理和检测方法。由于这款仪器的出色表现，于2007年不负众望勇折当年BCEIA桂冠。SA-10型形态分析仪 随后的几年中，根据检测市场的需求，吉天又先后开发出硒、汞、锑的形态分析方法，并在多个检测领域推广应用。尤其是对汞元素不同形态的检测条件的摸索，直接推动了深圳出入境检验检疫局和湖南出入境检验检疫局关于汞形态行标的制定，为我国海产品的出口检测做出重要贡献。而SA-10也经过反复改进，升级为SA-20型形态分析仪，仪器性能有了进一步提高。SA-20型形态分析仪 这款仪器的诞生无疑为当时过分依赖进口仪器而国产仪器普遍疲软的的检测市场注入了一针强心剂，中国除了制造也可以创造。当然同为一类色谱联用技术的高端仪器“液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用仪”不得不直面形态分析仪带来的挑战。毫无疑问，与价格高昂、运行成本昂贵、操作复杂的“液质联用”仪相比，形态分析仪在中国现有的经济条件下更具备普适性，就如同当年原子荧光一样，形态分析仪的普及有着它独特的土壤，等到“春暖花开时”必定会红遍大江南北。 现在，这股春风来了！随着食品中砷汞检测新国标的正式实施，形态分析仪这个国产仪器的宠儿再一次被推到了风口浪尖。只不过这次不再是吉天来唱独角戏，而是整个原子荧光厂商的联袂演出。我们可喜的看到经过众多国内仪器人的努力，国产仪器的整体实力有了飞跃式的发展，当下的时代再不是“唯进口论”的时代，为国产仪器而发声的呼吁越来越多。这场大戏刚一开锣，舞台上的群演们就按捺不住，吵得沸反盈天，煞有群猴大闹凌霄殿的气势，个个誓要在猴年把这猴戏唱到底，殊不知这闹得天宫的只有那吉天大圣一人，我们暂且不评论这场开年大戏，先来看看这佛祖的经文上写了什么。 此次国标GB 5009.11当中将2003版的GB/T 5009.11“食品中总砷及无机砷的测定”这一标准名称改为“食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定”，仔细辨认标准号少了一个T，这意味着 “砷标”从此由推荐标准升级为强制标准，既然上升到国家食品安全的高度那么无机砷由过去的总砷超标才检测变为必须检测，这对检测人员的职业技能是个不小的考验。取消了总砷测定的砷斑法及硼氢化物还原比色法，取消了食品中无机砷测定的原子荧光和银盐法。毫无疑问，手工方法一直存在着操作繁琐，重现性差的缺陷，此次被取消意料之内。增加了食品中总砷测定的电感耦合等离子体质谱法；增加了食品中无机砷测定的液相色谱与原子荧光光谱法和液相色谱与电感耦合等离子体质谱法。那么重点来了，ICP-MS被作为总砷检测的第一方法，意味着这一国际上常用的方法，逐渐被国内所接受，在未来将会对原子荧光产生不小的冲击。今天主扒形态分析仪，总砷的测定方法暂不展开论述。而无机砷的检测的第一方法被规定为液相色谱与原子荧光联用法，这是各原子荧光厂家为之躁动的主要原因，为什么不将液相色谱与ICP-MS联用的方法作为第一方法而选了液相与荧光联用作为第一方法，小编猜测除了ICP-MS操作繁琐，运行成本高，现阶段不利于推广外，还与它本身原理上存在的问题会对砷信号产生影响有关。从总体上看“液相色谱与原子荧光光谱联用”这一标准方法前处理相对简单，对于含油脂脂肪和大分子蛋白质的样品专门设计了样品净化的过程，可降低色谱柱的损耗。当然作为一类针对性强的标准，也存在部分不足。比如标准中只列出了稻米样品、水产动物样品和婴幼儿辅助食品三类样品的提取方法，而对于广泛食用的植物性水产品没有给出相应提取方法。所有样品均用稀酸浸泡过夜，虽然提高了提取率，但是也延长了检测周期。对于动物性水产品洗脱采用梯度程序，提高了无机砷与有机砷的分离效果，但是流动相平衡时间较长，检测一个样品所用时间为32分钟，那么做一条7个点的标准曲线就需要将近4个小时，同时还要消耗掉大量的反应试剂，这不利于样品的大量检测。另外，整个标准缺乏相应的编制说明或指导性文件，没有向操作者解释条件选择优化的过程和机理以及遇到问题后的解决对策。吉天拥有成熟的应用案例，可在两小时内完成样品的提取，并且可以在等度条件下完成动植物水产品的检测，提高检测效率。 另一个备受关注的国标GB 5009.17将2003版的GB/T5009.17“食品中总汞及无机汞的测定”改为“食品国家安全标准 食品中总汞及无机汞的测定”，这也意味着“汞标”同样成为食品安全标准而被强制推行。取消了总汞测定的二硫腙比色法，有机汞测定的气象色谱法和冷原子吸收法，和“砷标”类似手工检测方法存在重现性差的缺陷，而气象色谱法和冷原子吸收法的检出限和灵敏度均不及原子荧光光谱法。增加了甲基汞测定的液相色谱-原子荧光光谱法（LC-AFS），并作为甲基汞检测的第一法被写入该标准。这同样为形态分析仪的全面爆发，吹响了号角。从整体上看，甲基汞的检测方法与吉天早期摸索的方法类似，均是将样品经酸提取后，用C18反相柱分离，分离液再经紫外消解将有机汞转化为易于氢化物发生的无机汞，然后被原子荧光检测。这一方法分离效果佳，检测速度快，但是也存在一些不足，比如标准中对样液的pH 范围的规定太宽泛，2-7的范围足以影响到样品中目标组分的电离度，进而影响样品极性，造成甲基汞在反相柱中的分离状况出现差异。另外标准溶液以流动相定容，这又与样品pH不一致，造成两个基体间存在差异。150mm的色谱柱虽然能将无机汞和甲基汞分离，但是分离效果不佳，如果改用250mm的色谱柱分离效果会更好。吉天自主研发的恒温混悬离心集成系统，可在短时间内完成样品的提取，无需浸泡过夜，超高效的紫外消解装置，不需要通入辅助氧化剂，简化了管路，减小柱后扩散的风险。 以上是关于食品新国标的简单分析，不难看出吉天的形态分析仪足以满足国标方法的要求，而吉天长期摸索的检测方法，又是对国标方法的补充，既可以满足广大用户对国标方法的需求，又可以适应不同类型用户对特殊方法的需求。 这次食品国标对“液相色谱与原子荧光光谱联用”技术的肯定，将为形态分析仪带来新一轮的采购热潮，连锁反应下又会带动仪器生产、销售以及终端检测甚至技能培训环节的快速增长，这对国产仪器扩大影响力是个很好的契机，我们呼吁各位仪器界同仁在赚得盆满钵满的同时，认真思考国产仪器的未来，积极探索国产仪器突围的新道路，相信通过各界关心国产仪器同仁们的努力，国产仪器真正与进口仪器分庭抗衡公平竞争的时代指日可期。