腺相关病毒

基因治疗是通过将修饰的基因传递至靶细胞中，从而把患者体内的突变基因替换为相对应的健康基因拷贝来实现治疗或者预防疾病的目的。与传统的药物治疗相比，基因治疗是从根本上对疾病进行控制，所以有着非常好的发展前景，在世界范围内得到越来越多医药行业的关注和投入。 将正常基因（外源）导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。 病毒越来越多的用作载体，用于传递基因治疗的遗传物质和疫苗应用。重组腺相关病毒（recombinant Adeno-Associated Viruses, rAAV）是基因治疗最为常用的病毒载体之一。 一、如何开发高效安全的 rAAV 疗法?为了开发通过受控和经济的制造工艺生产的高效的 rAAV 疗法，需要解决从病毒衣壳设计到确定最佳工艺和配方条件，再到全面质量控制的多重挑战。应对这些挑战，需要针对 rAAV 样品下列属性进行量身定制的分析表征： Ø 测定衣壳蛋白或者颗粒滴度（capsidor particle titer）Ø 完整 rAAV 颗粒的百分比Ø 空-载比（Full-empty ratio）Ø 颗粒的粒径Ø 聚集体形成（aggregate formation）Ø 热稳定性（Thermal stability）Ø 基因组释放（genome release）Ø 衣壳电荷（capsid charge）等 而所有这些都可能影响最终产品的关键质量属性（CQA）。 通常，rAAV 滴度和病毒载量是使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、定量聚合酶链式反应（qPCR）、液滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）、分析超速离心（AUC）和电子显微镜（EM）的技术组合测定的。这些方法通常既费时又费力，而且其准确性和精确性也值得怀疑[1]。因此，业内越来越需求一种不依赖于使用专用试剂和昂贵的参考标准品的快速分析解决方案。 动态光散射(DLS)、多角度动态光散射（MADLS）、电泳光散射（ELS）、尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）、纳米颗粒跟踪技术（NTA）、等温滴定量热法（ITC）和差式扫描量热法（DSC）可以提供有关病毒载体的关键分析和质量属性的重要信息，从而能够对多种参数进行表征、比较和优化。 样品关键参数马尔文帕纳科的技术方案衣壳蛋白尺寸DLS、NTA衣壳蛋白及转基因的绝对分子量SEC-MALS (OMNISEC)衣壳滴度或颗粒计数MADLS, SEC-MALS(OMNISEC), NTA含基因病毒颗粒百分比分析SEC-MALS (OMNISEC)聚集形成分析DLS, MADLS, SEC-MALS (OMNISEC), NTA碎片化分析SEC-MALS (OMNISEC)热稳定性分析DLS, DSC高级结构分析DSC血清型鉴定DSC衣壳解聚及基因组注入DLS, DSC衣壳蛋白尺寸ITC电荷分析ELS表1 总结了病毒载体研究中各种重要的关键属性（CQA），以及马尔文帕纳科可以对应提供表征此类信息的各项技术。 DLS、MADLS、SEC-MALS、NTA、ITC和DSC属于无标记的生物物理技术，需要最少程度的方法开发，并且可以很容易的应用于各个阶段，强化了基因治疗开发的分析工作流程。 二、高效的表征技术概念解读动态光散射（DLS）动态光散射(DLS)是一种非侵入式技术，可以测量由颗粒分散体系或分子溶液引起的散射光强度随时间的波动。由于进行布朗运动的颗粒或者分子的随机运动，散射光的强度会随之发生波动。使用自相关算法分析这些强度波动可以确定平移扩散系数，随后根据斯托克斯-爱因斯坦方程确定流体力学尺寸。多角度动态光散射（MADLS）多角度动态光散射（MADLS）通过使用三个不同的检测角度（背面、侧面和正面）并将获取的光散射信息组合成一个与角度无关（Angular-Independent）的粒径分布，从而可以对多模态的样品进行更高分辨率的尺寸测定。应用MADLS技术的扩展还可以测量出颗粒浓度（Concentration）。电泳光散射（ELS）电泳光散射（ELS）测定来自在电场中进行电泳的颗粒或者分子的散射光的频移（Frequency Shift），并能够计算出Zeta电位。颗粒的Zeta电位是颗粒在特定介质中获得的总电荷，可用于预测分散体系的稳定性并深入了解所研究的颗粒的表面化学。尺寸排阻色谱（SEC）尺寸排阻色谱（SEC）是一种分离技术，可根据分子进出柱中多孔凝胶基质的流体力学半径来分离分子。搭配一系列先进的检测器，如光散射（LS）、UV、RI和粘度，可以测量绝对分子量、分子大小、特征粘度、支化和其他参数。差式扫描量热法（DSC）差式扫描量热法（DSC）是一种直接分析天然蛋白质或其他生物分子热稳定性的技术，无需外在荧光素或者内源荧光，它通过测定在恒定的升温速率下使生物分子发生热变性过程中的热容变化来实现。 案例研究 | 综合使用多种技术表征 rAAV性状：衣壳分子量、聚集状态、滴度、稳定性… … 1，空 rAAV5 衣壳分析SEC-MALS (OMNI-SEC)测量产生的关键数据是绝对分子量，与柱保留时间或用于校准系统的任何标准无关。在空rAAV的情况下（Fig.1 和表2），主要单体的Mw为3.84 x 106 g/mol。空衣壳蛋白的理论分子量为3.8 x 106 g/mol，证实该分析结果符合预期。 图1 rAAV5 空壳三重色谱图表2 rAAV5空壳的定量参数 Mw/Mn 描述样品的分散性，接近1的值表示峰中有单个群体，远高于1的值表示峰内有多个群体。在空 rAAV 的情况下，单体和二聚体的 Mw/Mn 值接近1，表明是单一群体。聚集体和碎片 Mw/Mn 值显著高于1，表明单个峰内具有不同分子量的多个群体（表2）。 样品的分数（Fraction of Sample）描述了样本在群体之间的分布情况，在这种情况下，84.7% 的样品是单体。蛋白质分数（Fraction of Protein）表示样品中衣壳的百分比；在这种情况下，单体是99.8%的衣壳。这证实样品是空的 rAAV5 。从这种单一分析方法中获得的另一个关键信息是样品滴度；在这种情况下，对于空的 rAAV5，测得的滴度为 5.91x1013 vp/mL。 2，完整 rAAV5 衣壳分析完整 rAAV5衣壳的SEC-MALS (OMNISEC) 分析如图2和表3所示。对于主要的单体峰，计算出的符合Mw为4.49 x 106 g/mol，其中86%为衣壳。这样，完整的rAAV5的蛋白质组分的Mw为3.86 x 106 g/mol，与表2中的空rAAV5衣壳生成的数据一致。单体部分占比93%，样品具有总滴度7.48 x 1013 vp/mL。 图2 完整 rAAV5 的三重色谱图表3 完整 rAAV5 的定量参数 3，rAAV5 稳定性研究病毒衣壳的稳定性和功能是一种平衡行为。病毒衣壳必须足够稳定以包含和保护其中的基因组，与宿主细胞表面结合，它们必须提供足够的构象稳定性以在复制位点释放基因货物。 AAV载体脱壳的机制仍然知之甚少。衣壳脱壳和基因组释放似乎需要结构变化。基于差示扫描荧光法和差示扫描量热法（DSC）收集的AAV热稳定性已发表数据，AAV热转变的Tm值与衣壳解聚过程有关，可作为AAV血清型的鉴定指标；一种血清型的空AAV衣壳和完整AAV衣壳的Tm值通常非常相似，并且它们与衣壳动力学、衣壳脱壳和基因组释放没有明显的相关性。 图3 空rAAV5 和完整 rAAV5的DSC数据比较，扣除空白和基线的DSC数据。垂直方向标记的区域具有明显不同的热转变过程。表4 从DSC获得的空 rAAV5 和完整 rAAV5 样品的热稳定性结果 文章中记录的完整和空 rAAV5 样品的DSC曲线叠加（图3），根据空 rAAV5 和完整rAAV5 样品的整体 DSC 图谱差异以及热稳定性参数（如 Tonset 和 Tm2，表 4），可以在图 3 中 DSC 曲线上识别出四个不同的区域，它们可以暂且归因于以下几点：#1■ 仅在完整的 rAAV5 中出现的区域，从50℃一直延展至 75℃，这个过程大约 30 分钟。这可能归因于热应激下衣壳蛋白结构和稳定性变化导致的 ssDNA 的动力学控制下的注射；#2■在空 rAAV5 中出现的最明显的预转变过程；#3■ 主要转变过程，即协同的 rAAV5 衣壳蛋白发生解组装，这由具有血清型特异性的 Tm 值所决定；#4■ 仅在完整 rAAV5 中出现的另外的转变过程，很可能归因于 ssDNA 的解链。结论：以上几例是综合应用马尔文帕纳科多种互补技术对基因治疗常用的AAV载体一些关键属性的表征，这些无标记生物物理技术需要最少的方法开发，可以从衣壳设计阶段到开发、配方开发和药物原料和产品进行深入表征，加强体内基因治疗开发的分析工作流程。 详细内容可参文献 (Pharmaceutics 2021, 13(4), 586 https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13040586）[1] Burnham, B. Nass, S. Kong, E. Mattingly, M. Woodcock, D. Song, A. Wadsworth, S. Cheng, S.H. Scaria, A. O’Riordan, C.R. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum. Gene Ther. Methods 2015, 26, 228–242 三、纳米粒度及电位分析仪：DLS/ ELS/ MADLS 马尔文帕纳科 Zetasizer Ultra 纳米粒度及Zeta电位分析仪具有真正的多角度动态光散射技术（MADLS® ），提供更高的粒度测量分辨率，及与角度无关的粒度结果，并能够测量颗粒浓度。图4 Zetasizer Ultra纳米粒度及Zeta电位分析仪 四、OMNISEC 凝胶渗透色谱仪：GPC/SEC马尔文帕纳科OMNISEC凝胶渗透色谱仪是一套完整的凝胶渗透/尺寸排阻色谱(GPC)/(SEC)，有前端色谱分离系统、检测器和软件组成，是灵敏准确的多检测器GPC/SEC 系统，可以准确测定：Ø 绝对分子量和分子量分布Ø 特性粘度和分子结构Ø 样品浓度Ø 以及其他多种关键参数图5 OMNISEC凝胶渗透色谱仪 五、PEAQ-DSC 微量热差示扫描量热仪：DSC 马尔文帕纳科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量热差示扫描量热仪能够帮助用户快速确认维持高级结构稳定性的最佳条件，提供简洁、无缝的工作流程和自动化批量数据分析，其所提供的热稳定性信息被业内视为“金标准”技术，是一种非标记、全局性的数据。图6 MicroCal PEAQ-DSC 微量热差示扫描量热仪 关于马尔文帕纳科马尔文帕纳科的使命是通过对材料进行化学、物性和结构分析，打造出更胜一筹的客户导向型创新解决方案和服务，从而提高效率和产生可观的经济效益。通过利用包括人工智能和预测分析在内的技术发展，我们能够逐步实现这一目标。这将让各个行业和组织的科学家和工程师可解决一系列难题，如提高生产率、开发更高质量的产品，并缩短产品上市时间。 联系我们：马尔文帕纳科销售热线: +86 400 630 6902售后热线: +86 400 820 6902联系邮箱：info@malvern.com.cn官方网址：www.malvernpanalytical.com.cn

#本文由马尔文帕纳科应用专家冯慧庆供稿# 基因治疗是生物制药行业中一个快速增长的领域，通过基因治疗可实现疾病的治疗或预防。其中，重组腺相关病毒(rAAV)是目前基因治疗领域研究较多的一类病毒载体。腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一，一般，研究中采用的重组腺相关病毒载体（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。目前，rAAV的准确定量分析和表征的难度是阻碍基因治疗快速发展的关键因素。我们常常需要对rAAV进行综合全面表征，比如衣壳数量、实心率、颗粒尺寸、聚集体比例等。传统情况，rAAV滴度和病毒载量采用ELISA、ddPCR、AUC和EM等技术进行测量。但这些方法通常费时费力，而且精确度不高。本文通过GPC/SEC和多角度动态光散射（MADLS）两种分析技术分析rAAV5样品，展示了快速、准确和可靠地定量测量AAV的病毒滴度（AAV Titer）和实心率(% full AAV)的方法。 01仪器参数OMNISEC GPC/SEC多检测器系统非常适合于生物医药行业，可用于全面表征rAAV样品。OMNISEC包含一个示差折光检测器(RI)，紫外线全波长阵列检测器(UV-Vis 190-900 nm)和光散射检测器，仅需一次进样，可精确测量绝对分子量、聚集体比例、病毒滴度和实心率。与传统HPLC不同，测量过程不依赖柱保留体积，也不需要一系列标样进行色谱柱校正。图1显示了使用OMNISEC测量的CQA关键质量参数。02检测方法我们采用Empty和Full rAAV5两个样品作为分析案例。Full rAAV5 载有已知分子量为785 kg/mol的PFB-GFP ssDNA。经qPCR和ELISA测量方式可知，该样本的病毒滴度为2.5x1013。采用色谱柱P4000和P3000串联，对rAAV样品的进行色谱分离。由OMNISEC软件采集分析测试结果，其中硬件系统包含OMNISEC RESOLVE(包含泵、自动进样器和柱温箱)和OMNISEC REVEAL（包含示差、UV/PDA和直角90°/小角7°光散射检测器）。样品经过分离洗脱后，使用共聚物分析方法确定样品两种不同组分的浓度和分子量。计算方法如下：其中，ConcCapsid是衣壳浓度(mg/mL)，NA是阿伏伽德罗数，Mwcapsid是衣壳的分子量(g/mol)，ConcDNA是DNA浓度(mg/mL)，MwSeqDNA是来自序列的ssDNA的分子量。因此，通过计算出的颗粒浓度，可以很容易地得出样品实心率的百分比。 03检测结果案例一：图2显示了Empty rAAV5的三检测色谱图。RI信号由红色曲线表示，260 nm紫外信号由紫色曲线表示，直角光散射(RALS)信号由绿色曲线表示。样品包含四个部分：单体峰保留体积(RV)在12.5ml，碎片在16ml ，二聚体在10.5ml ，聚集体在8.5ml 。使用共聚物分析方法，可以得到表1结果。单体的分子量为3.84×106g/mol。衣壳的理论分子量为3.8×106g/mol，证实分析结果与预期相符。MW/Mn为分子量分布，描述了样品的分散性，单体和二聚体的值接近1，而聚集体和片段均显着高于1，表明在同一峰内有多个不同分子量的组分。Fraction of Sample表示样品组分百分含量，单体所占百分比为84.7%。Fraction of Protein显示了样品中衣壳的百分比，单体包含99.8%的衣壳。这证实了样本确实是Empty rAAV5。最后Empty rAAV5样品总滴度为5.91x1013Vp/ml。 案例二：第二个样品Full rAAV5的三检测器色谱图如图3所示。图中显示了与Empty rAAV5截然不同的色谱峰。分析色谱图可以看出，只包含两个不同的组分，其中单体峰，大概12.5ml RV处，包含Full 和Empty rAAV5的混合物，而聚集体出现在8ml RV处。测试结果见表2。对于主体的单体峰，计算出其混合物分子量为4.49×106g/mol，其中86%为衣壳。rAAV5的蛋白质组分的分子量为3.89×106g/mol，这与表1中Empty rAAV5 的数据一致。单体是总体的93.2%，样本的总滴度为7.48x1013VP/ml。其中单体包含78% Full rAAV5，22% Empty rAAV5。需要注意的是，这种分析方法假设样品要么是Full ，要么是Empty ，忽略部分装载或过度装载情况。Zetasizer Ultra纳米粒度及电位仪可以使用MADLS方式快速确定病毒滴度。从OMNISEC获得的数据与Zetasizer Ultra的粒子滴度进行了比较，两种技术之间有很好的相关性，见图4。另外，本文将Full rAAV5和Empty rAAV5以确定比例混合，来对Full rAAV5样品进行分析。表3显示了每个样品的预期值和实际值Full rAAV百分比。图5显示了期望值和实际值之间有很强的相关性，证实了OMNISEC确定样品实心率结果的可靠性。为了进一步评估OMNISEC对rAAV样品准确表征能力，我们进行了rAAV5样品的热应力稳定性研究，同时，基于ZS Ultra对聚集体的极高灵敏度，我们利用了ZS Ultra表征rAAV5聚集体的微小变化。测试条件是将rAAV5样品置于25oC到80oC之间进行测试。在不断加热过程中，在每个温度下测量rAAV5样品的粒径。在25oC和35oC之间，没有观察到粒径的变化。从35oC开始，可以观察到粒径开始增大，这表明样品开始发生变化(图6A)。30oC和45oC下的数据比较清楚地显示了这些样品之间的大小差异(图6B)。我们选择45oC条件，对OMNISEC进行进一步稳定性研究。将rAAV5样品在稳定在45oC，分别在2min 、5min、10min和15min后，取样品到OMNISEC上测试。图7色谱叠加图显示样品发生了明显的变化，聚集体百分含量增加，单体浓度含量降低。表4显示MW在此潜伏期内保持稳定，单体峰中的AAV百分比也保持稳定。结论：在这项研究中，我们展示了OMNISEC和Zetasizer Ultra在综合分析表征rAAV5样品的能力，以及将两者联合使用的应用价值。 OMNISEC多检测SEC系统将示差折光检测器、紫外全波长检测器、光散射检测器集成一体化设计，具有更高的灵敏度和准确度，通过一次进样分析，可提供各种血清型AAV样品的绝对分子量、衣壳大小、滴度、实心率、聚集体、片段和样品稳定性等关键质量属性。虽然这些参数中很多都可以使用传统的生物化学方法来确定，但OMNISEC提供了更为简单、可靠的方法，正逐渐成为一种表征分析AAV通用的技术工具。

文/Tosoh Bioscience应用科学家Heidi Vitrac, Ph.D.前言新冠疫情把病毒变成了每个人共同的一段切身经历，尽管如此，我们仍需记住，并非所有病毒都是危险的。事实上，一些病毒能够起到输送生物治疗剂的作用。在进行基因治疗时常会用到这项技术，可以通过修改患者基因达到治疗或治愈疾病的效果。基因治疗主要分为以下几种方式：通过专业技术人员实现正常基因的拷贝与致病基因的替换，使功能异常基因失活，或向体内引入新基因或修饰基因。选择方案三时，病毒载体——特别是使用AAV的病毒载体，可以说是极为有用。首先，由于其固有的自然设计，病毒载体进入细胞的效率极高。其次，该病毒载体的复制需依赖于与其他病毒的共感染，这点使其不具有致病性。最后，至少有12种不同人血清型AAV，其各自感染的细胞类型不同，使其可用于靶向特定类型细胞的治疗。AAV载体是由蛋白质和DNA组成的有着精确构造的复杂生物分子组合。理想情况下，科学家可以造出含预期单链DNA的细胞衣壳。但是，系统并不完美。存在产生无任何DNA的空衣壳及部分填充的衣壳的风险，这些不良衣壳可能会导致治疗无效或疗效降低。因此，开发生产及测量AAV衣壳的可靠方法是非常需要的，包括但不限于测量DNA属性（如基因组完整性、AAV DNA修饰和衣壳中存在的部分DNA）以及衣壳自身属性（如衣壳的特性、病毒蛋白占比、聚集体等）。这正是SEC和MALS可以发挥作用的地方，特别是在给药试验中基因组滴度测定及聚集体或空壳、部分和完整AAV测定方面。SEC-MALS的威力要了解SEC-MALS法的威力，首先要了解光散射分析的优势和过程。光束照射到溶液中的分子时，分子内会产生振荡偶极子，此时光会向各个方向重新射出。一般来说，光的射出量与分子量有关；但是，散射光的强度随其散射方向不同而有所差异。为了收集到最精确的分子测量数据，应从多个不同角度来测量散射光。东曹生命科学的LenS3 MALS检测器从极小角度（10度）、极大角度（170度）和直角，三角度散射光检测模式，来计算分子大小。根据分子是大还是小，可以调用不同的角度。检测器单次运行即可获得三个关键质量属性的量化数据：颗粒浓度、衣壳含量和聚集度。典型的仪器配置如图1所示。事实上，该方法的主要优势是其所需的系统改造最小也最简单。分析高分子量的AAV时，首先必须选择合适的东曹TSKgel® SEC色谱柱才能获得分析和鉴定各种杂质所需的合适分离度（图2）。然后，可以根据具体分析和需求进行深入优化或微调。最后，SEC-MALS从三个方面为AAV表征提供最有力的方法支持：使用LenS3实现超高灵敏度，测定完整／空壳比率时的增强准确度，及测定AAV聚集体和杂质的能力。灵敏度和准确度总的来说，相较于传统UV检测，LenS3检测的灵敏度优势明显（图3）。与UV260和UV280检测相比，MALS法的灵敏度明显更高，特别是检测AAV时，由于这些病毒的分子量相当大，因此其后续在MALS中的光散射信号响应十分强。事实上，如果所选的色谱柱适当，即使浓度极低，如每毫米粒子数仅为4×109，也可以使用MALS实现检测。另外，研究表明，直角光散射（RALS）信号和衣壳含量在较大的浓度范围内呈明显的线性相关，这为颗粒定量测定置信度提供了保证。制备AAV时一般会产生三类衣壳：空衣壳（不含单链DNA）、部分衣壳（含完整长度基因组DNA的片段）和完整衣壳（含所需基因组材料的完整长度）。由于所需产品是完整的AAV衣壳，因此测定完整／空衣壳占比是一个关键的质量属性要求。目前，SEC-MALS法尚且无法区分完整衣壳和部分衣壳，仅可区分完整衣壳和空衣壳。好消息是，同样的SEC-MALS法测定分子量的能力十分强大，也可用于测定AAV衣壳的DNA含量。如图4所示，将RALS信号强度与预期百分比数据进行比较，研究人员发现RALS信号与衣壳DNA含量之间呈明显的线性相关。简而言之，该方法能够精准预测分子量，将制剂中空衣壳含量降低至2%左右。SEC-MALS法的灵敏度、准确度和精密度明显优于280 nm和260 nm的UV检测法，这要归功于科学家能够制备出更高密度完整衣壳混合物样品，从而产生更强的信号响应。利用MALS还可以最大限度地降低测定DNA时的不准确度。随着细胞内DNA含量的增加，细胞本身变得更加坚实，细胞内能量减少的检测也变得更加容易。这些附加数据的获取能够增加测定完整／空衣壳比率的置信度。本质上讲，SEC-MALS法更容易识别蛋白质的聚集体和片段，同样归功于LenS3检测器具有出色的灵敏度。未来应用AAV下游工艺的主要挑战之一是有效分离所需的完整AAV与纯化后的残留杂质。如果将SEC-MALS法用于未纯化样品，能否应对这一挑战？结果显示，大部分杂质可通过较高的UV响应（如：UV@280 nm，16分钟内）检测出来。但UV检测法对于完整的AAV并不适用。事实上，由于密度问题，14.5分钟左右时仍未检测到AAV衣壳的UV信号。这也是SEC-MALS法发挥作用的地方，它能够检测和定量具有复杂基质的样品。简而言之，SEC-MALS法为分析各种血清型的AAV提供了最灵敏、最强大、最稳健的工具。这一论断对生产和质量控制两个阶段都适用。SEC-MALS也可用于分析AAV以外的其他病毒。科学家总能想出新的基因递送策略，东曹生命科学也总有相应策略与之应对。对小病毒颗粒研究得出了与AAV的试验相似的结果，并实现了高效分离。东曹生命科学对这些病毒颗粒进行了高效分离和分子量测定，通过质量单位与能量换算得出12.8纳米的结果——与该病毒颗粒的报告值完美匹配。简而言之，SEC-MALS法不仅可应用于AAV，也为其他各种应用创造了无限可能。