提取方法

自20世纪诞生以来，分子生物学迅速发展并在整个生命科学领域广泛渗透和应用，推动了传统医学进入基于分子层面实验科学的现代生物医学时代。核酸提取和纯化是分子生物学试验的基础，在以下应用实验中都需要进行核酸提取： ● 分析基础研究和疾病研究中的基因表达；● 跟踪对药物治疗的反应(例如，在抗病毒治疗期间和之后监测病毒滴度）；● 识别新物种并深入了解进化过程 (例如，Ancient DNA分析）；● 对人类、动物和植物中引起传染病暴发的病原体进行监测和分类；● 通过微生物检测和量化监测食品和水安全；● 诊断疾病 (如基因疾病，癌症，免疫学缺陷）。核酸提取纯化基本步骤 核酸纯化方法是影响提取核酸质量高低的最重要因素之一，也是下游分子生物学试验成败的关键，遵循提取纯化原则以及选择合适的纯化、浓缩方法，可以使核酸的质量及回收率达到最大化。 核酸提取纯化原则和要求 ● 需要保证核酸一级结构的完整性，为下游实验做准备；● 排除其它核酸分子的污染（提取DNA时排除RNA的干扰，反之亦然）；● 核酸样品中没有对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子；● 将核酸样品中其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低程度。 核酸提取纯化的常见方法溶液抽提法经典的DNA提取方法：酚氯仿抽法，主要是使用两种不同的有机溶剂交替抽提将蛋白去除。通过苯酚氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后，在水相中主要溶解的是以DNA为主的核酸成分，在有机相中主要是多糖和脂类物质，蛋白质则沉淀于两相之间。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀核酸，之后再离心分离和溶解洗脱，最后通过将洗涤后的核酸沉淀进行浓缩干燥即可得到高纯度核酸。 离心柱法（柱膜法）通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附DNA，而RNA和蛋白质顺利通过。硅胶膜表面的硅醇基团呈弱酸性，其水化后带负电。当溶液中存在一定浓度的阳离子后，形成的阳离子桥能够中和DNA和硅醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA牢固地吸附在硅胶膜表面。反之，处于低盐水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅醇基团与DNA磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放DNA。 利用高盐低PH结合核酸，低盐高PH值洗脱，来分离纯化核酸。离心柱纯化也是试剂盒提取中广泛的使用方法。磁珠法运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。磁珠法利用了磁性颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，先使用细胞裂解液裂解细胞，带有活性基团的磁性颗粒可特异性吸附从细胞中游离出来的核酸分子，而样品中的其他干扰物则很好的移除了，在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开完成，最后回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱，纯化浓缩后即可得到纯净的DNA，获得质量较高的核酸模板。 提取纯化方法的选择一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。如果对核酸提取的质量要求不高，可以选择经济实惠的溶液法，选择柱膜法还是磁珠法自动化提取，基本上取决于样本数量，针对大批量的样本，优选磁珠法自动化提取。如果对样本数量较少，则可以选择柱膜法，既快速又经济实用。对于Oligo寡核苷酸的纯化，实验要求更高。（可参考往期推文） 不管采用哪一种核酸提取纯化方法最后都离不开浓缩干燥！ ● 再浓缩核酸样品，随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，甚至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩，可将150uL DNA水溶液浓缩至10uL再进行测序；● 去除DNA样品中醇的残留，当DNA样品中有乙醇的残留会影响测序反应；● 干燥DNA样品。DNA沉淀后可能会含水或水/乙醇混合液，浓缩去除后可以得到干燥的DNA样品。常用的干燥方法：风干VS真空离心浓缩仪应用案例分享WTCHG（牛津大学人类遗传学威康信托中心) 使用Sequenom MassARRAYSNP 基因分型系统用于SNP分析，样品前制备过程分别使用风干（左）和Genevac EZ-2真空离心浓缩仪（右）干燥含有寡核苷酸样品的384孔板。下图结果表明，使用EZ-2真空离心浓缩仪干燥寡核苷酸样品，可以大大降低样品降解率，保证样品不会被污染，消除了样品损坏的潜在来源。深绿色-高样本数据质量浅绿色-中等样本数据质量红色-样品质量差或无数据使用真空离心浓缩仪，可以避免核酸浓缩干燥遇到的过度加热、绝对干燥、交叉污染及紫外损害保证核酸样品的完整性。Genevac真空离心浓缩仪浓缩干燥DNA样本，Genevac真空离心浓缩仪是合适的选择，Genevac系统广泛应用于DNA样品制备与纯化处理，不论是处理PCR前的简单的小体积浓度DNA pellets，还是高通量处理许多纯化DNA或寡核苷酸的样品，都有不同的机型可供选择。如果你对上述产品或方案感兴趣，欢迎随时联系德祥科技，可拨打热线400-006-9696。 Genevac英国Genevac是德祥集团资深合作伙伴之一。英国Genevac公司成立于1990年，隶属SP Scientific旗下，一直专注于研究和生产各种离心蒸发浓缩设备，其产品广泛应用于生命科学、制药、化学、分析等领域。德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。2009至2021年间，德祥先后荣获了“最具影响力经销商”、“年度最佳代理商“、”年度最高销售奖“等殊荣。我们始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！

“银杏” 植物界的大熊猫明代诗人刘熠曾有诗《赠古泉上人》：“花深竹石迷过客，露冷莲塘问远公；尽日苔阶闲不扫，满园银杏落秋风”。自古以来，银杏就是文人墨客和寻常百姓们都喜爱的一种植物。银杏是我国的特有树种，是现存种子植物中最古老的孑遗植物之一，有植物界“活化石”的美誉，但由于银杏多年来已停止演化，野外种群已濒危并被列入濒危保护植物，目前仅在我国浙江、湖北、贵州等地还存在着少量的野生银杏。不过，随着多年来对这位“植物界的大熊猫”持续的人工栽培和保护，银杏已在全国遍地开花。每到深秋时刻，从北京潭拓寺到苏州天平山，从桂林海洋乡到西安古观音禅寺，扇形的金黄色银杏叶都会挂满枝头，层林尽染，为各地带来温暖多彩的秋日元素，描绘阳光下如诗如画般的金秋胜景。而银杏可不仅仅是颜值高，意境风雅这么简单；银杏叶中含有一种重要的提取物：银杏黄酮，也叫 Ginkgo biloba P.E.，它能够增加脑血管血液流量，改善脑血管血液循环功能，保护脑细胞，扩张冠状动脉，预防心绞痛及心肌梗塞，预防血栓形成，提高机体免疫能力；对冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压病人均十分有益；广泛应用于制药、保健品、日用品、化妆品等各个领域。而要想从银杏叶中提取黄酮，历史最久、经验最丰富、成本最低的方法就是溶剂提取法，使用乙醇溶液、丙酮水溶液或氢氧化钠水溶液进行粗提取，再经过脱脂、去银杏酚酸等精制工序得到黄酮精提物。但这种方法的最大问题是实验时间长，产品中有机溶剂易残留。使用传统的萃取仪器进行提取银杏叶黄酮提取物时，若使用 60% 乙醇溶液，为得到最大的提取率，80℃ 实验条件下最少需要提取三个小时。考虑到粗提取完成后还要进行的其他工序，若样品量较大，这个时长会极大拖慢研究效率。因此一款步琦的全自动化的萃取仪就可以通过优化实验流程和自动化极大缩短实验时间，通常来说可以将三个小时的提取时间缩短到两小时以下甚至一小时以下（具体取决于实验条件），并支持多个萃取位置同时进行方法相同或不同的实验并单独控制每个位置，支持多种不同溶剂以适配不同的分析物和不同的方法。固液萃取仪 E-800步琦公司的全自动化六位一体固液萃取仪 E-800 功能强大，仪器含有上下两个加热盘，可以根据客户所需的实验方法打开或关闭上加热盘。操作界面是 7 英寸的彩色触摸大屏，专有 APP 可在移动设备上进行萃取远程监视及数据处理，萃取报告可从设备中传输到移动设备及电脑软件，可接入 LIMS 系统；内置标准索氏萃取法、索氏热萃取法、热萃取法、连续萃取法、Twisselmann 萃取法五种方法。可以全自动实现真正的索式萃取法：即底部烧杯中的溶剂受热蒸发，被上部的冷凝器冷凝回落到萃取腔中与样品萃取，萃取腔中的溶剂慢慢积累，当达到液位后溶剂回流到底部的烧杯中，完成一次循环，反复多次，直至完成萃取过程。实验过程既可以设定萃取时间，也可以设定循环次数。E-800 提供的六个独立的萃取位置，可实现单独过程控制，也可同时运行不同的萃取方法、使用不同的萃取溶剂。每道拥有独立液位传感器，根据样品量调节的液位传感器，极大地改善索氏萃取法的循环时间。显著提高每天的萃取效率和样品处理量。E-800 拥有可重复使用的砂芯样品杯，可替代一次性的纸滤筒，节约实验成本；分析物保护系统可始终保证烧杯中只剩下极少量的溶剂，从而实现最佳的分析物回收率。整个萃取过程完全可见。玻璃组件可轻松取放和拆卸，以便进行清洁和在烘箱中去除污染物。E-800 的全自动系统，创新的法兰 Z- 密封系统，密封性良好，极大降低溶剂损失，配合高性能冷凝器，溶剂回收率最高可达 90% 以上，极大解决提取银杏叶黄酮这类实验过程中溶剂回收率低和样品中溶剂残留的问题。溶剂自动回收到可拆卸的溶剂回收瓶中，可重复使用，极大降低成本。而烧杯底部独特的磨砂设计可以防止溶剂爆沸。虽然人工栽培的银杏已经在金秋时节点缀了全国各地的大小城市，但作为一种仍不具备足够的野外生存能力的树种，银杏仍需我们长期持续的保护。研究银杏，从中提取黄酮等对人有益的天然产物，可以帮助我们更好地对它们进行保护。人类从大自然中汲取了许许多多的资源，合理适当的回馈自然，有益于人与自然的长期和谐共处。步琦作为实验室前处理设备领域的专家，愿持续提供更高效便捷、更人性化、更对自然友好的解决方案，助力研究人员进行各类天然产物的提取与分析，助力一个更美好的未来。

01 摘要全氟和多氟烷基物质（PFAS）是一类在各种工业中广泛使用的人造化学品，得益于其对非粘锅和灭火泡沫等产品的优异性能。这类化合物的稳定性和普遍应用已经导致它们在环境中的积累，并且缺乏有效的去除技术使得它们能够在人类和动物体内生物积累。已经证实，PFAS 会引发人体健康问题，包括癌症、内分泌干扰和不孕等。因此，对土壤和组织等环境固体样本的监测变得至关重要。EDGE PFAS&trade 系统是一个为从固体样本中提取 PFAS 设计的自动化溶剂提取系统。在本研究中，我们依照美国环保署 1633.1 方法，使用 EDGE PFAS 从土壤和组织中提取了 40 种添加的 PFAS 化合物。自动化提取过程每个样本耗时不足 10 分钟，且获得了令人满意的回收率和相对标准偏差，同时确保系统中无交叉污染。对于希望实现固体样本 PFAS 提取自动化的实验室而言，EDGE PFAS 是最佳选择。02 引言在当今工业界，已有数千种全氟和多氟烷基物质（PFAS）被广泛应用。这些化合物因其出色的耐用性和生物累积性而被称为“永恒化合物”。PFAS 的结构包含一个碳原子主键，氟原子从该主键延伸出去，形成的强碳-氟键是这些化合物稳定性的关键。由于其广泛使用，PFAS 已通过生产和废水排放渗透到环境中，并进入水源。一旦进入水源，PFAS 可以迅速扩散，进而污染土壤和生物体组织。更严重的是，这些化合物在动物和人体内显示出生物累积性，且对人体的暴露已被证实会导致不良健康后果。因此，评估环境中 PFAS 水平对于保障人类健康与安全至关重要。美国环境保护局（EPA）提供了 EPA 第 1633 方法来分析包括土壤和组织样本在内的 PFAS。该方法中详细介绍的固体样本提取过程是一个漫长的手工操作。然而，由于该方法是基于性能的，只要满足质量控制要求，就可以对提取过程进行修改。EDGE PFAS 系统能够在不到 10 分钟的时间内完成土壤和组织样本的提取，自动化了溶剂添加、提取和提取物过滤过程。这为从这些固体环境样本中快速、高效、简便地提取 PFAS 提供了可能。在本研究中，我们利用 EDGE PFAS 有效地从土壤和组织样本中提取了 PFAS，并且获得了可接受的回收率和 RSD 值。动物组织是特别难以提取的基质，它增加了样本制备和分析的复杂性。使用 EDGE PFAS 系统，一个简单的方法就可以适用于许多不同的困难样本类型。03 材料与方法试剂与样本土壤参考物质（编号Soil 2022-110）购自北美能力验证测试组织（NAPT）。磨碎的鸡肉购自当地食品零售商，按照美国环保署（EPA）推荐的方法 1633，用作组织样本的代表基质。大部分使用的试剂包括 HPLC 级别的甲醇、HPLC 级别的水、氢氧化钾、甲酸和乙酸，均采购自 MilliporeSigma 公司。氢氧化铵由霍尼韦尔提供。内标替换 PFAS 溶液（PFAC-MXF）、原生全氟烷基醚羧酸和磺酸盐溶液（PFAC-MXG）、原生PFAS溶液（PFAC-MXH）、N-甲基/乙基 FOSA 原生溶液（PFAC-MXJ）、X:3 氟调聚羧酸原生溶液（PFAC-MXJ）以及质量标记的PFAS提取标准溶液（MPFAC-HIF-ES）均由惠灵顿实验室提供。所使用的净化材料，包括石墨化碳黑，由雷斯特克公司提供。用于 PFAS 分析的 OasisWAX 6cc 真空柱购自沃特世公司。EDGE 样本制备在使用前，每个 Q-Cup 需用甲醇冲洗并干燥。Q-Cups 装配 Q-DiscPFAS 后，分别称取 5 克土壤或 2 克磨碎的鸡肉加入其中。每个样本按照表 1 所示浓度添加了原生 PFAS。提取的内部标准（EIS）按照 EPA 方法 1633 所述浓度添加。每个样本都准备了四份。随后，将所有的 Q-Cups 连同聚丙烯离心管一起放入 EDGE PFAS 架子中，并依照所列方法在 EDGE PFAS 系统上进行提取。表1. 原生PFAS化合物的添加浓度EDGE PFAS 从土壤和组织中提取 PFAS 的方法Q-Disc: Q-Disc PFAS周期 1提取溶剂：甲醇中的0.3%氢氧化铵（土壤）或甲醇中的0.05 M KOH（组织）顶部添加：15 mL冲洗：0 mL温度：65º C保持时间：03:00（分：秒）周期 2提取溶剂：甲醇中的0.3%氢氧化铵（土壤）或甲醇中的0.05 M KOH（组织）顶部添加：10 mL冲洗：5 mL温度：65º C保持时间：03:00（分：秒）洗涤 1洗涤溶剂：提取溶剂洗涤体积：15 mL温度：65º C保持时间：00:15（分：秒）洗涤 2洗涤溶剂：提取溶剂洗涤体积：15 mL温度：---保持时间：--:--（分：秒）提取后净化处理样本在 55°C 下通过氮气吹扫浓缩至 7 mL，随后使用高效液相色谱（HPLC）级别的水重新稀释至 50 mL。使用 50% 甲酸或 30% 氢氧化铵调整样本的 pH 值，使其达到 6.5 ± 0.5 的范围内。接着，根据美国环保署（EPA）第 1633 方法，样本经由松散的石墨化碳黑和 WAX 固相萃取（SPE）进行净化。分析过程分析工作由沃特世公司采用 ACQUITY&trade Premier 系统完成，该系统配备了 Xevo&trade TQ Absolute 质谱仪。液相色谱（LC）系统经过沃特世 PFAS 分析套件的改造。化合物在 ACQUITY Premier BEH C18 色谱柱（2.1 mm x 50 mm, 1.7 µ m）上实现分离。进样量为 2 µ l，流动相 A 为 2 mM 乙酸铵水溶液，流动相 B 为 2 mM 乙酸铵乙腈溶液。使用的梯度程序详见表2。监测每种化合物的 MRM（多反应监测）跃迁所用的离子源参数详见表3。表2. 用于分离的超高效液相色谱（UPLC）梯度程序表3. 使用的源参数04 结果土壤和鸡肉样本均采用了一种简洁快速的自动化提取方法进行提取；两种样本类型使用了相同的参数，唯有提取溶剂例外。提取溶剂的选择遵循了 EPA 第 1633 方法的建议。无论样本类型如何，从溶剂添加、提取到过滤的整个过程均在 10 分钟内完成。所有样本均采用了统一的净化和分析流程。如表 4 所示，两种样本类型的全部 40 种原生 PFAS 化合物均达到了合格的回收率和 RSD 值。同时，表 5 显示，两种样本类型的提取内标也实现了令人满意的回收率和 RSD 值。采用传统的提取技术时，通常需要三个长时间周期才能有效提取土壤和组织样本，组织样本的提取时间甚至超过 16 小时。而通过 EDGE PFAS 技术，仅需两个短周期，每个周期 3 分钟，就能实现土壤和鸡肉样本的良好回收率。土壤样本的回收率略高，RSD 值也更为集中，不过所有数据均处于可接受范围内。这一细微差别可能源于鸡肉样本中较高的脂肪含量及其他干扰物质的存在。组织样本被认为是提取过程中的一个具有挑战性的基质。对于这些难处理的样本，能够采用一种快速、简单且高效的自动化提取方法，将极大地助力那些面临大量 PFAS 样本分析需求的环境 PFAS 实验室。表4. 土壤和鸡肉中 40 种原生 PFAS 的平均回收率和RSD（n=4）表5. 土壤和鸡肉中提取内标的平均回收率值及%RSD（n=4） 05 结论全氟烷基物质（PFAS）的环境污染是一个全球性问题，其影响范围和程度随着检测技术的进步而日益显现。PFAS 在环境中的广泛分布已经触及地球上的多个角落，并在各种生物体内留下了污染的痕迹。随着我们对这一问题认识的深入，对于高效、快速的样本处理方法的需求也相应增加。在本研究中，我们采用了一种名为 EDGE PFAS 的技术，成功地从加标的土壤和组织样本中提取了 PFAS。这种方法不仅快速、简单，而且高效，能够自动化地进行大量样本的处理。实验结果显示，使用该技术获得的回收率和相对标准偏差（RSD）值均达到了可接受的水平。这一发现对于应对不断增长的样本处理需求具有重要意义，并为未来的环境监测和污染治理提供了有力的技术支持。参考1 United States Environmental Protection Agency. Method 1633 Analysis of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFAS)in Aqueous, Solid, Biosolids, and Tissue Samples by LC-MS/MS, Revision 1, January, 2024. 在本次项目中，我们得到了 Waters Corporation 的大力支持与帮助。他们负责对提取物进行深入分析，展现了卓越的专业能力。对此，我们深感感激，并对他们长期以来的积极参与和持续合作表示衷心的感谢。