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请教一下：谁能告诉我，有什么型号的色谱柱可用于分离大小在100bp到500bp的DNA 片段？我有30多个组分要分离。有公司向我推荐 Amersham公司凝胶过滤预装柱 ，但是价格都近两万，有朋友向我推荐岛津，等公司的c18柱子（ODS柱），便宜，不知道效果会不会差一些呢？如果可以，有没有国产的也能解决问题呢？有那些型号的可有用？请高手指点，谢谢！
一、实验目的 本实验目的了解PCR反应用来扩增DNA 特异性片段实验的的基本原理、实验方法和操作步骤，熟练掌握PCR反应基本体系配制和实验条件的设定。 二、实验原理 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增，主要过程如图6。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板;人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合;DNA聚合酶在72 ℃将单核苷酸从引物3"端开始掺入，沿模板5"—3"方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5"—3"核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，不过Innis M·A 发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。PCR技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。1. 模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。2. 引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。(1)尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。(2)避免具有明显二级结构(尤其是在引物3"—末端)的序列。(3)防止引物间的互补，特别要注意避免具有3"末端重叠的序列。(4)引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。(5)引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体，而且扩增微量靶目标或起始材料是粗制品，容易产生非特异产物。3. 缓冲液：PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是MgCl2，其浓度对专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5 mM左右(每种dNTP 的浓度为0.2 mM时)，浓度过高，使反应特异性降低;浓度过低，使产物产量降低。四种dNTP 浓度通常每种都是0.05 mM—0.2 mM。过高的浓度会导致错误掺入，浓度过低，则影响反应产物的产量。四种dNTP浓度应大体相同，其中一种若偏高，会诱发错误掺入，降低合成速度，过早终止延伸反应。另外dNTP 能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低，所以如果dNTP 的浓度有很大改变，MgCl2浓度也要改变。Taq聚合酶是一种耐高温聚合酶，用量通常是1—4 单位/100 ul，浓度过高，产生过多的非特异片段。4. 循环参数：PCR 循环是把起始材料加热到90—95 ℃，保持短时间使双链DNA 解链;然后冷却至37—55 ℃，使引物与模板退火;再升温至70—75 ℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。用DNA扩增仪时，94 ℃保持1 分钟可使模板的起始物完全变性。若用低于94 ℃的条件，则应适当延长时间。引物与模板退火温度由引物的长度及G+C含量决定。适时间退火(1—2)分钟有利于产物的特异性。引物延伸在70—75 ℃保温的时间可根据扩增DNA片段的长短来调节。正常情况下，每分钟可延伸1 Kb 的长度，常规PCR 一般为25—40个循环，若循环加长，则由于酶活性降低，聚合时间延长，引物及单核苷酸减少等原因，反应后期容易产生错误掺入，所以在满足产物得率前提下，应尽量减少周期次数。三、材料(一)仪器与器皿PRC 扩增仪(PE2400)，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性指形管，凝胶成像仪 玻片(二)试剂与材料1. 琼脂糖凝胶电泳试剂1)电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04 mol/L PH8.0 0.002 mol/L EDTA2)加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖3)溴化乙锭溶液：0.05 mg/ml溴化乙锭/水4)琼脂糖2. TaqDNA 多聚酶3. 5′反应缓冲液：125 mmol/L Tris-HCl pH8.2;10 mmol/L MgCl2;0.5 mg/ml gelatin;125 mmol/L(NH4)2SO4; Formamide 25%4. 混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2 mmol/L)5. DNA 模板(每2 ml 中含有10 fg 待扩增DNA)6. 引物 1 (25 pmol/L)，5’加入EcoRI 粘性末端碱基7. 引物 2 (25 pmol/L)，5’加入HindIII 粘性末端碱基8. 无菌水四、实验步骤1. 按顺序在200 ml 指形管中加入以下试剂与样品：(因购入的试剂批次不同，加样时有 所差别，以预实验结果为准。)1) ddH2O 74 ml2) 10′Buffer 10 ml3) MgCl2 6 ml(10′Buffer 如已加入MgCl2，则不必加)4) dNTP 2 ml5) 引物1 2 ml6) 引物2 2 ml7) 模板 2 ml8) Taq DNA聚合酶2 ml总体积共100 ml(也可以配成40 ml 的反应体系)2. 在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：(以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数，见示范。)预变性 94 ℃ 2 分种循环条件(30 次)变性 94 ℃ 40 秒复性 55 ℃ 35 秒延伸 72 ℃ 2 分10 秒延长延伸 72 ℃ 7 分钟编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。3. PCR 扩增完毕，配2%琼脂糖凝胶，取15 ml 反应液及相适应的PCR mark 分别点样， 加样缓冲液应为40%W/V 蔗糖，电泳观察结果。4. 凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA 片段。注意事项： 要想得到预期的实验结果，PCR的反应条件和很多参数有着密切的关系，都应引起注意。在实验设计中我们要考虑到模板浓度的大小，设计引物时也要主要引物长度适当以及恰当的GC含量，在PCR体系中引物浓度，dNTPs浓度相对要均衡，选取的taq enzyme，缓冲液的离子含量也是影响产物的结果，另外就是要根据产物大小设定适当的变性时间，退火温度及时间，延伸的时间。
我的一个朋友学生物的，最近正发愁如何对DNA片段进行液相分析。问了下，DNA片段是人工合成的，所以基体并不复杂，目的是通过对目标物的测定，表征之前的生物过程效果（内切什么的），分子量3000左右。由于自己对生物学方面知识薄弱（早已忘记了DNA分子化学结构为何、有何基团），没有提出意见。回来查了一下。首先看到的是Transgenomic公司wave商品名的DNA分离分析系统。看了下介绍，原来所谓的“分子桥”就是离子对色谱法。对于阴离子（磷酸基团PKA1为1-2）的核酸片段，通过加入三乙基胺醋酸盐，与之形成离子对，通过三乙基胺的疏水性与C18作用，形成保留，然后用乙腈洗脱，似乎没什么专利的内容。后来发现，关键在于那根特别的C18链的DNA分析柱，“无孔多苯乙烯-二乙烯基苯 (PS-DVB)共聚物微球(3微米)与C18形成稳定的固相”。疑问1：这种非硅胶基质的C18柱有何神奇之处？硅胶基质的C18为能不能做（估计不能，要不就不是专利了）？（硅胶表面的硅羟基会不会和DNA有什么反应）疑问2：有孔与无孔，对于这种大分子有何不同？孔径方面要选多大的，120A的会堵柱子么？疑问3：wave仪器的柱温为50-80度之间，分别应对非变性，部分和全部变性。这里的变性为何？一般柱温箱和C18的柱子柱温上限为多少？文献方面，看到一些用强阴离子交换（SAX）做的。tris-HCl缓冲系统，pH控制在9。此时DNA片段挂在SAX柱上。然后通过NaCl梯度淋洗（Cl-竞争?），洗脱下DNA分子片断。自己并不懂离子色谱。疑问1：SAX柱怎么使用和维护？需要注意什么？硅胶基质的和聚合物基质相比除了pH耐受性外有何不同？疑问2：为何选用NaCl淋洗？淋洗完后，挂在柱上的季胺上的Cl-怎么办？疑问3：此方法与那个wave相比，优点和缺点为何？其实疑问有很多，就不一一列出了，希望有经验的前辈多多发言，不吝赐教，小生感激涕零。
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