流感病毒分离

一、目的流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。二、范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离。三、程序（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。（二）材料1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）3、HEPES缓冲液，1M母液 4、D-MEM培养基，Hank's液5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素 6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液7、临床样品0.5mL8、1mL无菌移液管9、10mL无菌移液管10、15mL无菌离心管（三）实验步骤1、准备病毒生长液（1）细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入①青、链霉素母液 5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：0.2%）③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：25mM）（2）病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细胞分离步骤：（1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。①用40×物镜观察细胞生长状态。②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。（2）细胞培养瓶的接种①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。⑤放置于33～35℃培养箱培养。⑥每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。（3）细胞培养物的收获当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。

人的流感病毒根据RNP和M蛋白的抗原性不同，分为甲（A）、乙（B）、丙（C），三个型流感病毒。甲型又根据HA和NA的抗原性不同，再区分为若干亚型甲型流感病毒（HnNn）。HA和NA易发生变异，其变异有两种形式，一种是抗原漂移，医学教`育网搜集整理其变异幅度小，属量变，这种变异可引起中、医学教`育网搜集整理小型规模的流行；另一种是抗原转换，其变异幅度大，形成新亚型，由于人群对新亚型流感病毒缺乏免疫力，往往酿成较大规模的流行或发生世界性大流行。

新华网东京12月14日电 日本鹿儿岛大学的一个研究小组以甲型H1N1流感病毒感染人体的机制为切入点，开发出一种能快速检测甲型流感病毒的新方法。 该研究小组日前发布的公报说，甲型H1N1流感病毒会与人体细胞表面的糖链结合，进而感染细胞。鹿儿岛大学教授隅田泰生等人以此为突破口进行研究，人工合成了人体细胞表面的这种糖链，使其附着在极微小的金粒表面。 在实验中，研究人员将含有甲型H1N1流感病毒的患者唾液与上述金微粒混合后放入离心装置。被病毒附着的金微粒由于质量较大，能被分离出来，而且得到的病毒浓度较高。 目前判断某人是否感染甲型H1N1流感病毒，首先要用简易检查工具对其进行检测，尔后再让病毒的基因增殖，进行聚合酶链式反应检测。但由于在感染初期，甲型流感病毒在感染者体内还未增殖到足够数量，因此现行简易检查的结果可能呈阴性。而新方法由于分离出的病毒浓度较高，不会出现这样的失误。 报告说，新方法只需30分钟左右就能判断被检测者是否感染甲型H1N1流感病毒，而包括聚合酶链式反应在内的现行检测法用时更长。此外，与从被检测者鼻腔深处采集样本相比，新方法采用唾液，被检测者没有不适感。 目前，该研究小组正与兵库县的一家企业合作开发采用这种新方法的检测仪器。又要有新仪器问世啦！