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1 引言南瓜食品是世界上公认的特效保健食品。由于原料来源广泛便宜,生产投资少、见效快,市场前景广阔,具有巨大的经济效益。南瓜粉是一种高钙、高锌、高钾、低钠食品, 特别适合于中老年人、糖尿病和高血压患者食用。南瓜粉防治糖尿病已被国内外所公认。研究证实,绝大部分Ⅱ型糖尿病患者服用南瓜粉后,可以使血糖降低,说明南瓜粉具有降血糖和升胰岛素的作用。南瓜防治糖尿病是在环丙基氨酸、果胶及几种微量元素和维生素等成分共同作用下实现的。因为南瓜粉是一种高钾低钠食品,而钾在人体内起着调节渗透与平衡的作用,高钾低钠饮食对预防心血管疾病、治疗浮肿有明显效果,所以南瓜粉适合于高血压和肾病患者食用。采用酶法水解南瓜中的可溶性糖,可使其降解为寡糖。为了进一步增加产率,提高成本,酶固定化技术应用到了南瓜食品加工工业中。酶的固定化可回收及重复利用。因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。与水溶性酶相比,固定化酶易于将固定化酶与底物、产物分开, 方便后续的分离和纯化;可以在较长时间内连续生产;酶的稳定性和最适温度提高, 最适pH值改变, 对温度和pH值适应范围增大, 对抑制剂和蛋白酶敏感性降低;酶反应条件容易控制;较水溶性酶更适合于多酶反应;可以增加产物的收率, 提高产物质量;酶的使用效率高,使用成本低;适于产业化、连续化、自动化生产。本文采用3种不同的固定化酶法对α-淀粉酶和低聚糖酶进行固定化,选择最佳固定化方法。2 材料与方法2.1 主要材料南瓜,市售日本南瓜;α-淀粉酶3700U/mL,北京奥博星生物技术有限责任公司;低聚糖酶20000CU/g,武汉鑫华远科技有限公司;海藻酸钠,AR,天津市光复精细化工研究所;3- 氨基丙基三乙氧基硅烷,AR,佛山市道宁化工有限公司。2.2酶的固定化方法的选择本试验首先选用3种固定化酶法,即海藻酸钠包埋法、共价交联法和大孔硅球吸附法对α- 淀粉酶进行固定,通过单因素试验得到了3种固定化方法的最佳方案和最大固定化率,之后选用最佳方法对低聚糖酶进行固定,并通过试验得到低聚糖酶的最佳固定条件。2.2.1包埋法固定α- 淀粉酶的单因素试验包埋法包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中这样可以防止酶蛋白释放, 但是底物仍能渗人格子内与酶相接触。包埋材料主要有琼脂、琼脂糖、卡拉胶、海藻酸钠、聚丙烯酞胺、纤维素等。因为海藻酸钠具有无毒、安全、价格低廉、材料易得的特点,故本试验采用海藻酸钠作为包埋材料。2.2.1.1 海藻酸钠的浓度的选择分别配制浓度为3%、4%、5%、6%、7%的海藻酸钠溶液,使之在沸水浴中搅拌溶解,加入等体积酶含量为0.45 mg/mL的α-淀粉酶液,搅拌均匀。静置1 h后,滴入至2%的CaCl2溶液中,形成直径为5 mm左右的海藻酸钙凝胶珠,在4℃下静置固化1 h[
在下新手,做的是固定化酶毛细管柱,样品是一种小蛋白,能够在柱上分解同时分离,可是分的峰形不是很理想。想请教下大虾们:1.样品溶液的配置(用缓冲,水。其他)注意什么?2.在电泳的时候遇到过一种情况,条件都相同,可能过了半天样品峰会多出个肩峰,这是为什么?老师说是操作的问题,不是很懂。。。3.如何将两个结构很相似的物质分的开点?谢谢!!!
固定化酶的性质受酶自身性质和载体材料共同影响。这两者之间的相互作用决定了固定化酶的物理化学和动力学特性。因此,载体材料的选择在整个酶的固定化过程举足轻重。尽管大家都意识到载体的重要性,但是迄今为止,仍然没有一种载体材料是通用的。想成为酶的通用性载体材料,必须拥有一系列的优秀特性:对蛋白质具有高的亲和力,和酶分子有直接可进行反应的功能团,可以进行化学修饰,具有亲水性,化学稳定性,一定的机械强度,比较容易形成不同的几何结构以提供相应的渗透性,其表面对于生物转移合适等等。毋庸置疑的,在药学,医学,食品业以及农业应用中,载体材料还须是无毒的,并且具有生物相容性。考虑到对公共健康和环境的友好性,载体材料还应该可以生物降解,更经济。综合考虑到现在已经被人们用来做固定化的载体材料,包括无机材料和有机材料,天然的和人工合成的,几丁质是众多材料中性质非常优良的载体材料。几丁质是天然的聚多糖,几丁质是世界上数量最多的一类可再生有机资源。几丁质是甲壳类动物的壳以及昆虫的外骨骼的主要成分,在生物圈中,每年都有大量的几丁质被合成和降解。几丁质(chitin)是N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键所连接而成的直链多糖,在许多溶剂中都是不溶解的。几丁质的结构与植物纤维素的结构非常相似,只是2号位碳原子上的羟基被乙酰氨基和氨基所取代,因此又称作动物纤维素。值得一提的是,几丁质不是简单的化学物质,在最初以及制造的过程中可呈现出多样化的结构。实验部分实验试剂和仪器实验试剂:猪胰脂肪酶Lipase from porcine pancreas,Type Ⅱ(sigma);牛血清蛋白(BSA,成都飞克生物试剂有限公司,分析纯);考马斯亮蓝G-250(沃宏化学品有限公司);聚乙二醇1500(PEG1500,成都市科龙化工试剂厂,分析纯);几丁质(sigma);25%戊二醛(成都市科龙化工试剂厂); 三丁酸甘油酯; 考马斯亮蓝G-250(国产);分析天平(万分之一级,Sartorius BS 124 S)。其他无机盐试剂均为分析纯。实验仪器:紫外分光光度计(Hitachi,U-1900);恒温振荡器(上海智城科学仪器有限公司 ZHWY-2102-C);低温冷冻离心机(日立CF15RX);涡旋混合仪(国产); pH计(雷磁科学仪器有限公司)双水相纯化PPL 将猪胰脂肪酶400毫克溶解于10毫升1M pH=7.0的磷酸钠缓冲溶液中,4℃搅拌溶解4h,在低温离心机中以8000rpm离心10min