六通阀原理

在2021最新版的Methods in Molecular BiologyLung Cancer第10章(127页开始)介绍了使用naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统检测NSCLC患者ctDNA样本中的19种活化和耐药位点，并对检测方法进行了详细的描述。naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统检测流程文中阐述，naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统多重检测速度快，每个患者样本可获得大量突变信息，通过naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统进行液体活检可实现高灵敏度和高效的治疗监测，早期发现治疗耐药性。Methods in Molecular Biology是Springer出版的权威分子生物学方法学系列著作，共1110册，涵盖了生物学的方方面面。包括生命科学、药物科学、化学、药学、材料学、细胞生物学、生物化学、人类基因组学、植物性、免疫学等。Lung Cancer就肺肿瘤生物学常用的实验方法进行了深入的讨论和细致的描述，包括用于建立肺癌诊断和预后的相关研究方法。naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

法国Stilla Technologies公司开发的—款多重PCR专用预混液：naica® multiplex PCR MIX（见表1），专用于naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统的多重检测。并对naica® multiplex PCR MIX的多重检测性能进行了详细评估。当面对有限的样本量时，可保证多重数字PCR检测的灵敏度和准确性；在复杂背景基因存在的情况下，依然能精确检出低丰度的目的基因。★ naica® multiplex PCR MIX在naica® 六通道微滴芯片数字PCR上进行6个靶标的同步准确定量采用0.2~13000cp/ul的DNA样品，使用10X naica® multiplex PCR MIX在naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统上进行6个靶标的线性范围分析，结果显示6个靶标的R2均＞0.99，说明在naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统上，能够可靠地实现6靶标同步准确定量（图1)。与2X和5X浓度的数字PCR预混液(dPCR Mixes)相比，10X浓度的数字PCR预混液体积加入量降低了50％至80％，最大限度地提高样品加入量。尤其是在检测低浓度样品或稀有靶标时，样品加入量的增加可提高检测灵敏度。▲ 图1：使用naica® multiplex PCR MIX在naica® 六通道微滴芯片数字PCR上进行6个靶标的线性分析，分别在蓝色、青色、绿色、黄色、红色和红外线6个通道进行检测。每个稀释点的DNA浓度分别为：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每个稀释度进行3次重复。结果显示6个靶标的R2均大于0.99，说明所有靶标的结果都高度真实可靠。★ 在复杂的背景基因下，对低丰度目的基因进行精确定量数字PCR的—个重要技术优势是能够在存在多个靶标扩增的情况下检测到低浓度靶标。为了评估naica® multiplex PCR MIX的稳定性。使用同一个目标DNA模板的不同浓度系列稀释液（0.2~ 13000 cp/uL)进行检测，同时其中掺入5种外部靶标模板（每个靶标的浓度为3000 cp/ul)。在不同测试条件下，结果均呈现良好的线性关系（图2A和2C)。这些结果与同一DNA 靶点在不同浓度下单独检测以及在不添加外部靶标的情况下获得的结果具有可比性（图2B和2D）。▲ 图2：使用naica® multiplex PCR MIX的扩增结果真实可靠。将pUC18质粒（图A和B)和pUC57质粒（图C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀释液在5个外部扩增靶标背景下（每个靶标为3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶标(B,D)的情况下进行定量检测，3次重复。线性拟合系数 R20.99，表明在不考虑多重背景的情况下，对所有靶标的测定结果都是真实可靠的。5个外部靶标的相对标准偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，显示出极好的重复性。★ naica® multiplex PCR MIX应用亮点☑ 实现数字PCR方法多重检测的高度稳定性和高检测灵敏度；☑ 可在naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统的动态范围内同时定量检测6个独立的DNA靶标，均具有良好线性关系；☑ 5X和10X的数字PCR预混液，提高了naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统高阶多重检测能力；☑ 10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的体积用量，从而增加DNA的加入量。在检测低浓度样品或稀有靶标时，样本加入量的增加可提高检测灵敏度。表1 naica® multiplex PCR MIX货号及规格naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

往复筒法和流池法都是药物体外释放度研究中常用的方法，它们都能在实验过程中通过改变各种不同溶出介质来模拟人体胃肠道内变化生理环境，所以有些文献会称之为“生物相关方法”（Biorelevant Methods）。但是，这两种方法的结构和设计差异决定了其测试样品会面对两种不同的流体状态，并最终影响实验数据。本文将通过对比往复筒法和流池法在某缓释制剂体外释放度研究的测试结果，来分析两种方法之间的差异。实验方法为了控制测试过程中的变量，两种方法的实验参数将尽可能保持一致。例如，往复筒法和流池法均使用相同的取样时间点和溶出介质。另外，用于往复筒法的250mL溶出介质体积能够满足漏槽条件。由于技术保密协议，本文将省略实验方法的关键参数。往复筒法（USP Apparatus 3)溶出系统：锐拓RT3-AT 往复筒法自动取样溶出系统溶出介质体积：250 mL温度：37.0 ± 0.5 ℃流池法（USP Apparatus 4)溶出系统：锐拓RT7流池法溶出系统流通池：22.6mm内径 药典标准流通池温度：37.0 ± 0.5 ℃流通池底部放置一颗5mm直径的红宝石球，并填充1mm直径的玻璃珠。体外释放度结果往复筒法测试结果由于往复筒法拥有更大的流体剪切力，参比制剂和自研样品在10小时已经基本释放完全。参比制剂最终溶出率的RSD为1.6%，自研样品最终溶出率的RSD为2.3%，测试结果的重复性良好。自研样品的最终溶出率略低于参比制剂。 流池法测试结果流通池法测试样品在接近20小时才完全释放完全，更加符合这款药物24小时缓释的设计预期。参比制剂最终溶出率的RSD为1.4%，自研样品最终溶出率的RSD为2.8%，测试结果的重复性良好。同样可以观察到，自研样品的最终溶出率低于参比制剂。 结果讨论虽然两种测试方法均能够呈现自研样品的最终溶出率低于参比制剂的结果，但是就方法区分力而言，流池法还是明显优于往复筒法。流池法的测试结果能够更明显地呈现在整个药物释放过程中，自研样品与参比制剂之间的差异。 得益于流通池内平缓的恒速层流状态，药物能够在更加接近胃肠道的流体环境下进行体外释放，这更容易体现生产工艺和处方的变化对药物释放的影响。往复筒法则能够提供更大的流体剪切力，让药物释放速率明显加快，在缩短实验时间的同时，会在一定程度上牺牲了方法的区分力。降低往复速率可以减少流体剪切力，但实验数据证实，即使在很低往复速率的情况下（例如5 DPM)，其产生的流体剪切力依然高于流池法高流速下的流体剪切力。针对高剪切力这个特点，往复筒法更加适用于长时间体外释放度测定的加速实验，例如植入剂。通过比桨篮法和流池法更大的流体剪切力，加速药物释放进程，缩短实验时间。另外，往复筒法也适用于咀嚼片的释放度研究：在往复筒内填充玻璃珠配合上下往复运动来模拟药片在口腔内被咀嚼的状态。流通池法和往复筒法各有特点，我们应该根据实验目的来选择合适的测定方法，让测试结果能够满足我们的预期。