平均相对标准

酶标仪问世之初，是酶联免疫吸附试验(ELISA)的专用检测仪器。随着科学技术发展和市场需求演变，酶标仪被赋予的功能日益丰富。由最初的吸收光(ABS)检测，到荧光强度(FI)、发光检测(LUMI)，再到荧光偏振(FP)、时间分辨荧光(TRF)等检测技术，酶标仪早已突破了ELISA的范畴，在追“光”道路驰而不息。为帮助广大用户及时了解酶标仪前沿技术、主流品牌与创新产品、市场动态以及相关活动，仪器信息网特别策划了《从光吸收到多功能，酶标仪的“逐光”之路》专题(点击查看)。本期，我们特别邀请到瑞孚迪（Revvity）酶标产品经理刘欣毅谈一谈瑞孚迪酶标仪创新检测技术以及对酶标仪应用前景和未来市场的看法。仪器信息网：贵司目前主推的酶标仪产品是什么？请您谈谈该产品的核心竞争力。刘欣毅：目前我们主推的酶标仪是今年年初上市的EnVision®Nexus™多功能酶标仪，它是瑞孚迪迄今为止速度最快，灵敏度最高的多功能酶标仪，专为要求苛刻的高通量筛选（HTS）应用而设计，可加速药物研发进程。EnVision®系列酶标仪问世二十载有余，始终是高通量筛选（HTS）领域高端酶标仪的标杆产品。瑞孚迪秉承以技术原理为导向的硬件理念，对不同检测模式的光路进行独立设计和优化，以实现极高的检测灵敏度和高通量检测。全新EnVision®Nexus™采用FBD光路模块、增强型或高通量适配器以及一对高灵敏检测器（PMT）作为仪器的主光路；同时按不同检测技术配合高能固态激光和单光子检测器等硬件；外加优化的检测模式，达到极高的灵敏度。比如Nexus™的三种化学发光模式（标准、增强和超敏）下灵敏度分别达到3.75amol/孔、0.375amol/孔和0.015amol/孔。另一核心竞争力来自于瑞孚迪公司的“仪器+试剂”的整体方案，瑞孚迪是目前唯一拥有自主均相检测试剂平台的公司。EnVision®Nexus™搭配优化型试剂（包括专有的HTRF®和AlphaLISA®技术以及最新试剂盒），可帮助研究人员提高检测灵活性。瑞孚迪专业的技术团队始终与研究人员并肩前行，在实验设计、实验操作、仪器检测和数据分析各个环节提供优质的服务。EnVision®Nexus™多功能酶标仪仪器信息网：请介绍贵公司酶标仪发展历程中里程碑事件。刘欣毅：瑞孚迪是一家专注于生命科学和诊断的供应商，公司总部位于美国马萨诸塞州沃尔瑟姆。2022年瑞孚迪的营业额超过30亿美元，全球拥有 11000 多名员工的团队，为制药和生物技术、诊断实验室、学术界和政府用户提供解决方案、前沿技术和专业服务。瑞孚迪前身是珀金埃尔默生命科学与诊断业务公司。1996年，瑞孚迪推出世界上第一台多功能酶标仪VICTOR，奠定了在多模式检测领域的领导者地位。2002年推出了兼具高通量、高速度、高灵敏度以及极大灵活性的酶标仪EnVision®系列，成为行业标杆产品。2017年，首次将成像技术整合到了酶标仪上，推出EnSight®检测平台，为科学家提供了“酶标+成像”的正交实验解决方案。时至今日，位于德国汉堡的瑞孚迪酶标产品研发总部仍然坚持不断创新，持续深耕，力求将高质量高性能的产品交付给全球相关领域的研究工作者。仪器信息网：贵公司酶标仪主要应用哪些领域的哪些实验环节？有哪些代表性用户单位？刘欣毅：瑞孚迪酶标仪在科研和工业领域均有广泛应用，在基础研究领域：靶点发现和验证、分子机理、信号通路以及分子相互作用等研究；在工业领域：药物SAR优化、高通量筛选、药物代谢、毒理研究以及生产环节质控放行等环节。我们的代表用户包括国内外著名高校，如清华、北大、交大、复旦等；国家级科研平台，如中国科学院系统；政府职能部门，如药检所，省市级疾控中心等；药物研发生产公司，如全球著名药企、CRO公司和生物技术公司等。仪器信息网：请点评吸光度(Abs)、荧光强度(FI)、时间分辨荧光(TRF)、荧光偏振(FP)和化学发光(Lum)等不同酶标仪检测方法的优劣势？刘欣毅：从辩证的角度看，无论宏观世界里国家与国家之间的行为，还是微观世界里分子间行为造成的生物学性状改变，本质都是相互作用。而酶标仪应用于生命科学相关领域的研究活动，也正是对相互作用进行分析和检测。酶标仪检测方法统称多模式检测技术，这是区别于放射性技术的一类方法。从最早（上世纪70年代）的非放ELISA方法（基于吸光度、荧光或发光）来代替同位素实验（RIA）起，研究人员对方法学开发的脚步从未停止。几乎每隔10年，下一代技术就会出现以弥补当前技术的短板。80年代出现的时间分辨荧光技术（TRF）弥补了当时酶标仪光吸收灵敏度和动态范围的不足；90年代出现的时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET）则是从非均相实验（ELISA、DELFIA）到均相免洗方法的一次技术飞跃；而2000年左右出现的Alpha技术进一步把均相分子相互作用研究的适用性上升到了全新高度，涵盖所有分子水平相互作用的实验需求。存在即合理，目前多功能酶标仪包含的6大检测方法（吸收光、荧光、生物发光、时间分辨荧光、荧光偏振和Alpha）各自分别拥有不同的适用场景和优点，但也存在一定局限性。因此，态度严谨的研究往往会选择2种或以上的实验技术对存疑样品进行深入验证。仪器信息网：请谈谈酶标仪未来技术发展趋势？刘欣毅：未来，操作简单、检测通量高、稳定性能强以及使用成本低的酶标仪技术一定会承担更多的实验任务。无论基础科研还是药物研发生产，都是与时间竞赛。作为仪器厂商，我们不仅需要考虑仪器本身和配套试剂的成本，更需要考虑人力和时间的成本。个人认为，未来很长一段时间内，均相技术将成为酶标仪必争的技术平台，其原因在于均相实验在相互作用研究中具有不可替代的优势。自2000年以来，酶标仪平台并没有出现重大的技术革新，目前的研究通过生物发光共振能量转移（BRET）、时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 以及Alpha等均相技术都能获得比较稳定可靠的实验结果。仪器信息网：请介绍当前中国酶标仪市场规模及现状。过去三年最强劲的市场需求来自哪些领域？刘欣毅：根据BCC的研究数据显示，在过去的5年里，酶标仪全球市场增长率约8%，中国市场规模估计在150~200M美金，其中进口品牌占据60%左右。从功能上看，三功能及以下的酶标仪市场份额占比高达90%。虽然高端多功能酶标仪只有10%左右的市场份额，但其用户群体非常固定，即药物研发企业，国家级科研机构，高校国家重点实验室和政府职能部门（如药检所、疾控中心等）。过去三年处于一段相对特殊的时期，国内最强劲的市场需求来自两个方面：一是传染病相关研究，包括抗体检测、疫苗研究等；二是，全球大量药物研发相关项目转移至中国市场，传统公司研发能力饱和，大量中小型药企如同雨后春笋。而酶标仪作为药物研发必备工具之一，其市场需求也水涨船高。仪器信息网：未来中国酶标仪市场的发展前景如何？最看好哪些应用细分？刘欣毅：酶标仪现已成为实验的常规仪器之一。中国作为全球重要的科研阵地，对高端先进仪器设备和创新技术的需求一直处于高位。如果把酶标仪比作汽车，根据应用场景进行分门别类：若是城市通勤，那么十几万的家用车足够应付需求；若是游山玩水，那么百万级的越野车才能显示出其优势；若是在研发领域的高速赛道上，谁能够持续稳定地发挥出色性能表现，那么才会得到用户们的青睐。可以预见，随着中国科学家对靶标研究程度越来越精细化，“手术刀”级别的高端多功能酶标仪将会得到越来越多市场认可。而从应用细分来看，小分子药物、生物大分子药、细胞基因治疗以及类器官等将在未来几年成为市场追逐的热门领域。瑞孚迪生物医学（上海）有限公司酶标产品经理 刘欣毅刘欣毅先生，生物化学工程博士，担任国内知名CRO公司项目主管，熟悉高通量药物筛选全流程。在瑞孚迪生物医学（上海）有限公司（前身是珀金埃尔默生命科学与诊断业务公司）担任酶标产品经理10年，对于酶标仪行业有着非常深入的理解和经验。如有技术干货、科研成果、酶标仪使用心得等内容，欢迎投稿，投稿文章将在《从光吸收到多功能，酶标仪的“逐光”之路》专题（点击查看）展示并在仪器信息网相关渠道推广。投稿邮箱：zhaoyw@instrument.com.cn，关于征稿内容要求也可邮件咨询或电话联系：13331136682（同微信）。

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研究背景对于具有多成分、多靶点特点的中药来说，多组分共存时主要成分的体内过程研究对揭示中药体内复杂药效物质基础有重要意义。但由于中药成分的多样性和各成分间理化性质的差异性，中药生物样品中多成分的同步、灵敏、快速定量检测仍是一个艰巨的挑战。近年来，均相液液萃取方法已经成为蛋白分离纯化的重要手段之一。 该研究发现通过添加一定浓度盐或糖的水溶液，可使均相混合体系(如由血浆和有机相乙腈组成) 分层，同时利用相似相溶原理对目标分析物进行萃取。作者发现通过向有机溶剂-血浆均相体系加入质谱友好的挥发性盐(如甲酸铵、乙酸铵)的盐析辅助均相液液萃取方法兼具操作步骤简单、基质干扰低、提取回收率稳定的特点，可同步对多种不同极性的待测物进行提取分离，在保证选择性和灵敏度的同时提高了分析方法的通用性。 01方法与结果目标待测化合物中(结构见图1)，3种生物碱类成分和3种萜类成分在质谱正离子模式下有较好响应，而3种黄酮类成分在负离子模式的灵敏度更佳。利用岛津LCMS-8050高速正负极切换的性能特点，在保证高灵敏度的同时，单次分析中同时进行正负离子的多通道MRM监测(图2)。图1 柳胺酚内标和目标待测化合物的化学结构 图2 大鼠血浆QC样品中LIQ、DHE、ILIQ、LIQN、IS、RVN、LIM、OBA、EVO和RUT的代表性MRM色谱图 在样品前处理方法优化过程中，作者对比了6种前处理步骤对血浆样品中目标待测化合物基质效应和提取回收率的影响，6种方法分别为：(1) 甲醇蛋白沉淀(方法A)，(2) 乙腈蛋白沉淀(方法B)，(3)甲基叔丁基醚-二氯甲烷液液萃取(方法C)，(4)乙酸乙酯-正丁醇液液萃取(方法D)，(5)乙酸铵盐析辅助均相液液萃取(方法E)，(6)葡萄糖糖析辅助均相液液萃取 (方法F)。结果显示，对于9种目标待测化合物，使用乙腈蛋白沉淀的方法基质干扰明显；使用弱极性萃取溶液的液液萃取方法对极性较大的甘草苷和异甘草苷提取回收率低，进而影响分析方法的定量下限；而使用挥发性盐溶液和有机溶剂的盐析辅助均相液液萃取方法，既可以降低基质干扰又能保证各待测成分的提取回收率，对比另外两种原理的前处理方法，扩大了分析物的适用范围(图3)。 图3 空白血浆加标QC样品的萃取方法基质效应和回收率结果 作者还对盐析辅助均相液液萃取方法的挥发性盐种类和浓度进行了探究。总体上，同浓度的甲酸铵和乙酸铵溶液对盐析辅助均相液液萃取方法基质效应和提取回收率的影响相似(图4)，但对待测成分精密度和准确度的影响略有差异。此外，对于乙腈-血浆的均相体系，当体系中乙酸铵浓度增加到0.5 M后才会出现分层趋势(图5)。高浓度盐溶液的加入有利于均相体系盐析分层，但较高的盐浓度会降低负离子模式下的黄酮类成分的检测灵敏度。 图4 空白血浆加标QC样品的SALLE方法基质效应和回收率结果 图5 乙酸铵浓度对SALLE性能的影响 最后，对优化的方法进行了方法学验证，并成功应用于中药吴茱萸-甘草配伍的大鼠体内药代动力学研究中。 02 总结与讨论本研究开发优化了一种操作步骤简单、检测灵敏度高、化合物适用范围广的血浆样品LC-MS/MS高通量分析方法，利用岛津LC-30AD高速梯度精密送液和LCMS-8050高速正负极切换的技术特点，同步对极性差异较大的3种生物碱类、3种萜类和3种黄酮类成分进行了定量测定。LCMS-8050 03文献简介 文献题目《Simultaneous LC-MS/MS bioanalysis of alkaloids, terpenoids, and flavonoids in rat plasma through salting-out-assisted liquid-liquid extraction after oral administration of extract from Tetradiumruticarpum and Glycyrrhiza uralensis: a sample preparation strategy to broaden analyte coverage of herbal medicines》 使用仪器LCMS-8050，LC-30AD 作者Manlin Li1, Hanxue Wang1, Xiaohan Huan1, Ning Cao1, Huida Guan1, Hongmei Zhang2, Xuemei Cheng1, Changhong Wang1*1. Institute of ChineseMateria Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Shanghai Key Laboratory of Compound Chinese Medicines, 1200 Cailun Road, Shanghai 201203, China2. School of Pharmacy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China* Corresponding author. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China. Tel: 086-021-51322511, Fax: 086-021-51322519, E-mail: wchcxm@shutcm.edu.cn wchcxm@hotmail.com (Changhong Wang). 原标题：通过盐析辅助均相液液萃取方法和LC-MS/MS技术同步对大鼠血浆中的生物碱类、萜类和黄酮类成分进行定量分析上海中医药大学 中药研究所文章发表于Analytical and Bioanalytical Chemistry文章链接：https://doi.org/10.1007/s00216-021-03568-1 致谢本研究得到《上海市中医药事业发展三年行动计划》[ZY(2018-2020)-CCCX-5002]的资助。 声明1、本文不提供文献原文。2、所引用文献仅供读者研究和学习参考，不得用于其他营利性活动。3、本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。