耶拿梯度仪的原理

梯度稀释是微生物实验中的常规操作，在食品安全、生化医药，环境监测，卫生防疫，农业研究等领域都有广泛的应用需求。 微生物实验操作中最繁琐的步骤就是样品的稀释，需要实验人员的反复的加液振荡混合直到标准所需，人为的操作循环重复，也容易带来比较大的样品误差，给微生物工作者带来了太多的烦恼。您辛苦了！ 不过，现在有Tiya梯度稀释仪来帮您解围了！工作原理 参照传统人工稀释操作过程，遵循国家标准，恒奥科技以专业无菌操作理念打造出了自动化梯度稀释设备。 加注稀释液--加样--原位混匀--取换枪头--连续稀释，整个过程“一键搞定”。自动识别管位，操作简捷，上样连续可选，扩展功能丰富。特点 ※ 机型体积小巧，方便安装于层流超净工作台或局部百级净化区，也可自带FFU百级净化单元，动作幅度小，减少操作中空气扰动，避免污染。 ※开机自动校准注稀释液量（9mL、4.5mL），注液准确度有保证。高精密度注射泵样品移液，取液量1mL或0.5mL可选，确保一致性。 ※自动替换枪头，液体接触管路及部件均可灭菌消毒，保证稀释过程安全无菌，符合国家标准。 ※高效率样品稀释，无样品限量，每梯度稀释平均参考时间为15s，有效缩短实验时间。专利的原位混匀技术和专利防溅出试管设计，保证混匀过程一致有效，实现混匀样品的同时也防止交叉污染。 ※信息溯源：可储存5种稀释方案，人机交换操作方便明确，自动留存样品及操作人信息，可通过USB接口导出，方便追溯。配套专利试管 玻璃材质，可重复使用；按需提供，保证实验速度。也可选配经济型一次性试管（PP），免去清洗步骤，实验准备更快捷。应用实例1. 疾控系统及三方检测用于消毒剂杀菌实验中的梯度稀释。（消毒技术规范-2002版）2. 食品微生物检测中对样品液的稀释（平皿法和MPN法）。也可应用在益生菌生产过程中的相关检测。（GB 4789.2-2016 GB 4789.3-2016 等）3. 国家药典2020版四部通则中《1108中药饮片微生物梯度检查法》规定的样品稀释过程。4. 对于较高粘样品的样品梯度稀释，有专用的多次混合和清洗枪头程序可选择。（GB/T16347-1996)5. 环境卫生检测用于各种水质的微生物污染环境实验中。(GB 5750-2006)6. 该装置亦可根据用户需求定制扩展功能，用于样品转移，配比，稀释等。

Jo-Ann M. Jablonski、Thomas E. Wheat and Diane M. Diehl； Waters Corporation, Milford, MA, U.S. 引言 用于进行分离和纯化的色谱分离方法与分析型分离方法受到相同物理和化学原理的制约。然而，在制备型试验中，科学家通常在大型柱上和高质量负载下分离化合物，并需要更高的分离度以提高所收集组分的纯度和回收率。虽然设计更缓的梯度是提高分离度的一种较好的首选方法，但改变整个分离过程的梯度斜率可导致峰宽加大和总运行时间增加。可替代普通更缓梯度的聚焦梯度仅对需要增加分离度的色谱图部分减小梯度斜率，从而可在不增加总运行时间的情况下提高对洗脱时间接近的色谱峰的分离度。聚焦梯度可根据搜索运行或者直接从第一次制备运行进行定义。 试验方法 梯度开发步骤 ■ 确定制备规模的系统体积 ■ 运行搜索梯度 ■ 设计聚焦梯度 ■ 在制备柱上运行聚焦梯度 试验条件 仪器 液相色谱系统： 沃特世 2525型二元梯度模块、2767型样品管理系统、系统流路组织器、2996型光电二极管阵列检测器、 AutoPurification&trade 流通池 色谱柱： XBridge&trade 制备型OBD&trade C18柱19 x 50 mm、5&mu m（货号186002977） 流速： 25mL/分钟 流动相A： 0.1%的甲酸水溶液 流动相B： 0.1%甲酸-乙腈溶液 波长： 260 nm 样品混合物 磺胺: 10 mg/mL 磺胺噻唑: 10 mg/mL 磺胺二甲嘧啶: 20 mg/mL* 磺胺甲二唑: 10 mg/mL 磺胺甲唑: 10 mg/mL 磺胺二甲异唑: 4 mg/mL 总浓度: 64 mg/mL（溶于二甲基亚砜） *选定用于聚焦梯度的色谱峰 结果和讨论 确定制备规模的系统体积 ■ 取下色谱柱并更换成两通。 ■ 流动相A使用乙腈，流动相B使用包含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈（解决了非加成性混合和粘滞问题）。 ■ 在254 nm下进行监测。 ■ 采集100% A的基线数据5分钟。 ■ 在5.01分钟时，将梯度设置为100% B并再采集5分钟数据。 ■ 测定100% A和100% B之间的吸光度差异。 ■ 计算存在50%吸光度差异时的时间。 ■ 计算步骤开始时（5.01分钟）和50%时间点之间的时间差异。 ■ 将时间差异乘以流速。 系统体积被定义为从梯度形成点到色谱柱前端的体积。系统体积用于聚焦梯度的设计。如图1所示，本试验所用仪器配置下的系统体积是3.0 mL。 设计聚焦梯度 第1步 在2.47分钟洗脱3号色谱峰的溶剂浓度在较早的时间点上形成。如图3所示，检测器和梯度形成点之间的偏移量等于系统体积加上柱体积。用于这台特定系统的偏移量等于早期确定的3 mL系统体积再加上19 x 50 mm制备柱的体积（11.9 mL），即14.9 mL。在25 mL/分钟的流速下，溶剂浓度到达检测器需要0.59分钟。2.47分钟的洗脱时间减去0.59分钟的偏移时间等于1.88分钟。由于初始大规模梯度有0.39分钟的保留时间，因此形成洗脱色谱峰的乙腈百分比的时间是1.88分钟减去0.39分钟，即1.49分钟。 第2步 计算在2.47分钟洗脱色谱峰的乙腈百分比。原始大规模梯度在5分钟内洗脱 5-50% B，最初梯度的驻留时间为0.39分钟。 根据在2.47分钟洗脱出色谱峰的梯度计算得到的乙腈百分比是13.4%，但由于梯度开始于5%乙腈，因此洗脱该峰的乙腈实际浓度是13.4% + 5%，或者说18.4%乙腈。 第3步 旨在分离梯度中部洗脱时间接近的色谱峰的聚焦梯度应开始于原始小规模试验条件，通常为0-5% B。进样开始后立即将梯度快速增加至比能洗脱目标峰的预期乙腈百分比浓度低5%的乙腈百分比。在搜索梯度中所用的1/5斜率下继续进行缓的聚焦梯度部分。预计一个五倍的更缓梯度可为洗脱时间接近的色谱峰提供更高的分离度。终止高出可洗脱目标峰的预期乙腈百分比浓度5%的聚焦梯度部分。原始梯度在5分钟内洗脱5-50% B，或者说在5分钟内梯度变化45%。这样，乙腈浓度每分钟变化9%（从9%-10%左右简化得到）。然后，新的梯度斜率应为10%的1/5，或者说每分钟变化2%。10%的乙腈浓度改变通过每分钟变化2%而达到，说明用于分离3号和4号峰的聚焦梯度时间片段应持续5分钟。一旦梯度的聚焦部分完成，乙腈百分比快速增加至95% B，以清洗色谱柱。平衡色谱柱后，终止初始条件下的梯度。5-45% B = 每分钟9%（舍入至每分钟10%）梯度斜率每分钟变化2%。 聚焦梯度可明显提高图4所示色谱图中3号峰和4号峰的分离度。5号峰和6号峰因受到梯度聚焦部分的影响而出现移位，梯度部分继续在较缓的斜率下洗脱化合物，直至设定用于进行柱清洗的较高百分比的乙腈进入色谱柱。较缓的聚焦梯度能在不增加运行时间的情况下对天然混合组分提供更高的分离度，因而使色谱分析师能够获得更纯的产物和更好的回收率。 结论 当科学家为后续试验进行产物纯化时，需要在高质量负载下分离化合物。聚焦梯度可在不增加运行时间的情况下提高对洗脱时间接近色谱峰的分离度，从而改善分离效果。系统体积信息可以对制备型梯度进行直接优化。使用聚焦梯度可提高产物产率和纯度，同时不会增加溶剂消耗量和废液生成量。聚焦梯度方法可实现分离，因而有助于控制纯化成本。 关于沃特世公司 (www.waters.com) 50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。 作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。

近日，中国科学院深圳先进技术研究院研究员郑炜团队提出一种基于激发光梯度编码的快速三维成像技术，可使双光子体成像速度比传统技术提升5至10倍。　　双光子显微镜具有亚微米级的成像分辨率和毫米级的成像深度，被广泛应用在神经结构和功能成像以及其他活体成像研究中。传统的双光子三维成像是将双光子激发的焦点在样品中进行逐层的二维扫描来实现的，这种三维成像方法不仅速度受限且增加了样品暴露在高能激光中的时间，对生物组织造成光损伤和光漂白，不利于活体组织的长时间成像。　　该研究提出的新型梯度光场双光子显微成像技术只需要进行两次二维扫描即可获得样品的三维信息，极大降低了激光对样品的损害。　　在生活中，可利用编码来确定位置。与此类似，梯度光场技术设计了一对轴向拉长并且强度梯度变化的焦点，利用这对焦点的强度变化来编码并解析出物体的位置：横向扫描第一个梯度焦点得到的图像中，位置较浅处的样品荧光强度强，位置较深处的样品荧光强度弱，第二个焦点对应的图像则正好相反。两幅图像的和反映了样品的真实三维荧光强度，图像的比值则反映了荧光的深度信息。该方法可一次分辨深度12微米内三维信息，荧光点轴向定位精度为0.63微米。梯度光场双光子显微镜非常适合活体细胞的三维成像，在观测巨噬细胞吞噬荧光小球的实验中，能够快速捕捉荧光小球在巨噬细胞内外的三维运动轨迹，并精确定量出巨噬细胞运载小球的速度。　　相关成果以Axial gradient excitation accelerates volumetric imaging of two-photon microscopy为题，发表在Photonics Research上。研究得到国家自然科学基金重大科研仪器研制项目、重大研究计划以及广东省重点实验室等支持。 　　论文链接 （a）：梯度光场双光子显微成像原理、（b）：巨噬细胞吞噬小球过程、（c）：小球的运动轨迹、（d）：小球运动轨迹的量化与评估