气相色谱仪基本原理

高效液相色谱（HPLC）是色谱法的一个重要分支，其应用范围广泛，对样品的适用性广，且不受分析对象的挥发性和热稳定性的限制。 几乎所有的化合物，包括高沸点、极性、离子化合物和大分子物质都可以用高效液相色谱法进行分析测定，从而弥补了气相色谱法的缺点。 目前已知的有机化合物中，约20%可以通过气相色谱法进行分析，而80%需要通过高效液相色谱法进行分析。 高效液相色谱法具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度好等特点，可以分析分离高沸点且不能汽化的热不稳定生理活性物质。 分离与分析技术在该领域的重要应用。基本原理色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationphase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。高效液相色谱法以经典的液相色谱为基础，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有颗粒极细的高效固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。系统组成HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。此外，还可根据需要配置梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。

紫外吸收光谱UV 　　分析原理：吸收紫外光能量，引起分子中电子能级的跃迁 　　谱图的表示方法：相对吸收光能量随吸收光波长的变化 　　提供的信息：吸收峰的位置、强度和形状，提供分子中不同电子结构的信息 　　荧光光谱法FS 　　分析原理：被电磁辐射激发后，从最低单线激发态回到单线基态，发射荧光 　　谱图的表示方法：发射的荧光能量随光波长的变化 　　提供的信息：荧光效率和寿命，提供分子中不同电子结构的信息 　　红外吸收光谱法IR 　　分析原理：吸收红外光能量，引起具有偶极矩变化的分子的振动、转动能级跃迁 　　谱图的表示方法：相对透射光能量随透射光频率变化 　　提供的信息：峰的位置、强度和形状，提供功能团或化学键的特征振动频率 　　拉曼光谱法Ram 　　分析原理：吸收光能后，引起具有极化率变化的分子振动，产生拉曼散射 　　谱图的表示方法：散射光能量随拉曼位移的变化 　　提供的信息：峰的位置、强度和形状，提供功能团或化学键的特征振动频率 　　核磁共振波谱法NMR 　　分析原理：在外磁场中，具有核磁矩的原子核，吸收射频能量，产生核自旋能级的跃迁 　　谱图的表示方法：吸收光能量随化学位移的变化 　　提供的信息：峰的化学位移、强度、裂分数和偶合常数，提供核的数目、所处化学环境和几何构型的信息 　　电子顺磁共振波谱法ESR 　　分析原理：在外磁场中，分子中未成对电子吸收射频能量，产生电子自旋能级跃迁 　　谱图的表示方法：吸收光能量或微分能量随磁场强度变化 　　提供的信息：谱线位置、强度、裂分数目和超精细分裂常数，提供未成对电子密度、分子键特性及几何构型信息 　　质谱分析法MS 　　分析原理：分子在真空中被电子轰击，形成离子，通过电磁场按不同m/e分离 　　谱图的表示方法：以棒图形式表示离子的相对峰度随m/e的变化 　　提供的信息：分子离子及碎片离子的质量数及其相对峰度，提供分子量，元素组成及结构的信息 　　气相色谱法GC 　　分析原理：样品中各组分在流动相和固定相之间，由于分配系数不同而分离 　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化 　　提供的信息：峰的保留值与组分热力学参数有关，是定性依据 峰面积与组分含量有关 　　反气相色谱法IGC 　　分析原理：探针分子保留值的变化取决于它和作为固定相的聚合物样品之间的相互作用力 　　谱图的表示方法：探针分子比保留体积的对数值随柱温倒数的变化曲线 　　提供的信息：探针分子保留值与温度的关系提供聚合物的热力学参数 　　裂解气相色谱法PGC 　　分析原理：高分子材料在一定条件下瞬间裂解，可获得具有一定特征的碎片 　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化 　　提供的信息：谱图的指纹性或特征碎片峰，表征聚合物的化学结构和几何构型 　　凝胶色谱法GPC 　　分析原理：样品通过凝胶柱时，按分子的流体力学体积不同进行分离，大分子先流出 　　谱图的表示方法：柱后流出物浓度随保留值的变化 　　提供的信息：高聚物的平均分子量及其分布 　　热重法TG 　　分析原理：在控温环境中，样品重量随温度或时间变化 　　谱图的表示方法：样品的重量分数随温度或时间的变化曲线 　　提供的信息：曲线陡降处为样品失重区，平台区为样品的热稳定区 　　热差分析DTA 　　分析原理：样品与参比物处于同一控温环境中，由于二者导热系数不同产生温差，记录温度随环境温度或时间的变化 　　谱图的表示方法：温差随环境温度或时间的变化曲线 　　提供的信息：提供聚合物热转变温度及各种热效应的信息 　　TG-DTA图 　　示差扫描量热分析DSC 　　分析原理：样品与参比物处于同一控温环境中，记录维持温差为零时，所需能量随环境温度或时间的变化 　　谱图的表示方法：热量或其变化率随环境温度或时间的变化曲线 　　提供的信息：提供聚合物热转变温度及各种热效应的信息 　　静态热―力分析TMA 　　分析原理：样品在恒力作用下产生的形变随温度或时间变化 　　谱图的表示方法：样品形变值随温度或时间变化曲线 　　提供的信息：热转变温度和力学状态 　　动态热―力分析DMA 　　分析原理：样品在周期性变化的外力作用下产生的形变随温度的变化 　　谱图的表示方法：模量或tg&delta 随温度变化曲线 　　提供的信息：热转变温度模量和tg&delta 　　透射电子显微术TEM 　　分析原理：高能电子束穿透试样时发生散射、吸收、干涉和衍射，使得在相平面形成衬度，显示出图象 　　谱图的表示方法：质厚衬度象、明场衍衬象、暗场衍衬象、晶格条纹象、和分子象 　　提供的信息：晶体形貌、分子量分布、微孔尺寸分布、多相结构和晶格与缺陷等 　　扫描电子显微术SEM 　　分析原理：用电子技术检测高能电子束与样品作用时产生二次电子、背散射电子、吸收电子、X射线等并放大成象 　　谱图的表示方法：背散射象、二次电子象、吸收电流象、元素的线分布和面分布等 　　提供的信息：断口形貌、表面显微结构、薄膜内部的显微结构、微区元素分析与定量元素分析等 　　原子吸收AAS 　　原理：通过原子化器将待测试样原子化，待测原子吸收待测元素空心阴极灯的光，从而使用检测器检测到的能量变低，从而得到吸光度。吸光度与待测元素的浓度成正比。 　　(Inductivecouplinghighfrequencyplasma)电感耦合高频等离子体ICP 　　原理：利用氩等离子体产生的高温使用试样完全分解形成激发态的原子和离子，由于激发态的原子和离子不稳定，外层电子会从激发态向低的能级跃迁，因此发射出特征的谱线。通过光栅等分光后，利用检测器检测特定波长的强度，光的强度与待测元素浓度成正比。 　　X-raydiffraction,x射线衍射即XRD 　　X射线是原子内层电子在高速运动电子的轰击下跃迁而产生的光辐射，主要有连续X射线和特征X射线两种。晶体可被用作X光的光栅，这些很大数目的原子或离子/分子所产生的相干散射将会发生光的干涉作用，从而影响散射的X射线的强度增强或减弱。由于大量原子散射波的叠加，互相干涉而产生最大强度的光束称为X射线的衍射线。 　　满足衍射条件，可应用布拉格公式：2dsin&theta =&lambda 　　应用已知波长的X射线来测量&theta 角，从而计算出晶面间距d，这是用于X射线结构分析 另一个是应用已知d的晶体来测量&theta 角，从而计算出特征X射线的波长，进而可在已有资料查出试样中所含的元素。 　　高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE) 　　CZE的基本原理 　　HPLC选用的毛细管一般内径约为50&mu m(20～200&mu m)，外径为375&mu m，有效长度为50cm(7～100cm)。毛细管两端分别浸入两分开的缓冲液中，同时两缓冲液中分别插入连有高压电源的电极，该电压使得分析样品沿毛细管迁移，当分离样品通过检测器时，可对样品进行分析处理。HPLC进样一般采用电动力学进样(低电压)或流体力学进样(压力或抽吸)两种方式。在毛细管电泳系统中，带电溶质在电场作用下发生定向迁移，其表观迁移速度是溶质迁移速度与溶液电渗流速度的矢量和。所谓电渗是指在高电压作用下，双电层中的水合阴离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象 电泳是指在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。溶质的迁移速度由其所带电荷数和分子量大小决定，另外还受缓冲液的组成、性质、pH值等多种因素影响。带正电荷的组份沿毛细管壁形成有机双层向负极移动，带负电荷的组分被分配至毛细管近中区域，在电场作用下向正极移动。与此同时，缓冲液的电渗流向负极移动，其作用超过电泳，最终导致带正电荷、中性电荷、负电荷的组份依次通过检测器。 　　MECC的基本原理 　　MECC是在CZE基础上使用表面活性剂来充当胶束相，以胶束增溶作为分配原理，溶质在水相、胶束相中的分配系数不同，在电场作用下，毛细管中溶液的电渗流和胶束的电泳，使胶束和水相有不同的迁移速度，同时待分离物质在水相和胶束相中被多次分配，在电渗流和这种分配过程的双重作用下得以分离。MECC是电泳技术与色谱法的结合，适合同时分离分析中性和带电的样品分子。 　　扫描隧道显微镜(STM) 　　扫描隧道显微镜(STM)的基本原理是利用量子理论中的隧道效应。将原子线度的极细探针和被研究物质的表面作为两个电极，当样品与针尖的距离非常接近时(通常小于1nm)，在外加电场的作用下，电子会穿过两个电极之间的势垒流向另一电极。这种现象即是隧道效应。 　　原子力显微镜(AtomicForceMicroscopy，简称AFM) 　　原子力显微镜的工作原理就是将探针装在一弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变形，这样，微悬臂的轻微变形就可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。 　　俄歇电子能谱学(Augerelectronspectroscopy)，简称AES 　　俄歇电子能谱基本原理：入射电子束和物质作用，可以激发出原子的内层电子。外层电子向内层跃迁过程中所释放的能量，可能以X光的形式放出，即产生特征X射线，也可能又使核外另一电子激发成为自由电子，这种自由电子就是俄歇电子。对于一个原子来说,激发态原子在释放能量时只能进行一种发射：特征X射线或俄歇电子。原子序数大的元素，特征X射线的发射几率较大，原子序数小的元素，俄歇电子发射几率较大，当原子序数为33时，两种发射几率大致相等。因此，俄歇电子能谱适用于轻元素的分析。

p style=" line-height: 1.5em " & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp 气质联用仪是指将气相色谱仪和质谱仪联合起来使用的仪器。质谱法可以进行有效的定性分析，但对复杂有机化合物的分析就显得无能为力 而色谱法对有机化合物是一种有效的分离分析方法，特别适合于进行有机化合物的定量分析，但定性分析则比较困难。因此，这两者的有效结合必将为化学家及生物化学家提供一个进行复杂有机化合物高效的定性、定量分析工具。像这种将两种或两种以上方法结合起来的技术称之为联用技术，将气相色谱仪和质谱仪联合起来使用的仪器叫做气质联用仪。 br/ /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 基本应用 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　气质联用仪被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定，其具有GC的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。质谱仪的基本部件有：离子源、滤质器、检测器三部分组成，它们被安放在真空总管道内。接口：由GC出来的样品通过接口进入到质谱仪，接口是气质联用系统的关键。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　 strong 　GC-MS主要由以下部分组成：色谱部分、气质接口、质谱仪部分(离子源、质量分析器、检测器)和数据处理系统。 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 一、色谱部分 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　色谱部分和一般的色谱仪基本相同，包括柱箱、气化室和载气系统。除特殊需要，多数不再装检测器，而是将MS作为检测器。此外，在色谱部分还带有分流/不分流进样系统，程序升温系统，压力、流量自动控制系统等。色谱部分的主要作用是分离，混合物样品在合适的色谱条件下被分离成单个组分，然后进入质谱仪进行鉴定。色谱仪是在常压下工作，而质谱仪需要高真空，因此，如果色谱仪使用填充柱，必须经过一种接口装置-分子分离器，将色谱载气去除，使样品气进入质谱仪。如果色谱仪使用毛细管柱，因为毛细管中载气流量比填充柱小得多，不会破坏质谱仪真空，可以将毛细管直接插入质谱仪离子源。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　 strong 　二、气质接口 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　气质接口是GC到MS的连接部件。最常见的连接方式是直接连接法，毛细管色谱柱直接导入质谱仪，使用石墨垫圈密封(85%Vespel+15%石墨)，接口必须加热，防止分离的组分冷凝，接口温度设置一般为气相色谱程序升温最高值。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 三、质谱仪部分 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　质谱仪既是一种通用型的检测器，又是有选择性的检测器。它是在离子源部分将样品分子电离，形成离子和碎片离子，再通过质量分析器按照质荷比的不同进行分离，最后在检测器部分产生信号，并放大、记录得到质谱图。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 1.离子源 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　离子源的作用是接受样品产生离子，常用的离子化方式有: /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 电子轰击离子化 /strong (electron impact ionization，EI)EI是最常用的一种离子源，有机分子被一束电子流(能量一般为70eV)轰击，失去一个外层电子，形成带正电荷的分子离子(M+)，M+进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子或游离基，在电场作用下，正离子被加速、聚焦、进入质量分析器分析。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong EI特点: /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　⑴结构简单，操作方便。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　⑵图谱具有特征性，化合物分子碎裂大，能提供较多信息，对化合物的鉴别和结构解析十分有利。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　⑶所得分子离子峰不强，有时不能识别。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　本法不适合于高分子量和热不稳定的化合物。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 化学离子化 /strong (chemicalionization，CI)将反应气(甲烷、异丁烷、氨气等)与样品按一定比例混合，然后进行电子轰击，甲烷分子先被电离，形成一次、二次离子，这些离子再与样品分子发生反应，形成比样品分子大一个质量数的(M+1) 离子，或称为准分子离子。准分子离子也可能失去一个H2，形成(M-1)离子。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong CI特点 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　⑴不会发生象EI中那么强的能量交换，较少发生化学键断裂，谱形简单。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　⑵分子离子峰弱，但(M+1) 峰强，这提供了分子量信息。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 场致离子化 /strong (fieldionization，FI) 适用于易变分子的离子化，如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素、苯丙胺类等。能产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 场解吸离子化 /strong ( field desorption ionization，FD) 用于极性大、难气化、对热不稳定的化合物。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 负离子化学离子化 /strong (negative ion chemical ionization，NICI)是在正离子MS的基础上发展起来的一种离子化方法，其给出特征的负离子峰，具有很高的灵敏度(10-15g)。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 2.质量分析 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　其作用是将电离室中生成的离子按质荷比(m/z)大小分开，进行质谱检测。常见质量分析器有: /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 四极杆质量分析器(quadrupoleanalyzer) /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　原理:由四根平行圆柱形电极组成，电极分为两组，分别加上直流电压和一定频率的交流电压。样品离子沿电极间轴向进入电场后，在极性相反的电极间振荡，只有质荷比在某个范围的离子才能通过四极杆，到达检测器，其余离子因振幅过大与电极碰撞，放电中和后被抽走。因此，改变电压或频率，可使不同质荷比的离子依次到达检测器，被分离检测。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 扇形质量分析器 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　磁式扇形质量分析器(magnetic-sector massanalyzer)被电场加速的离子进入磁场后，运动轨道弯曲了，离子轨道偏转可用公式表示:当H，V一定时，只有某一质荷比的离子能通过狭缝到达检测器。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　特点:分辨率低，对质量同、能量不同的离子分辨较困难。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 双聚焦质量分析器 /strong (double-focusing massassay)由一个静电分析器和一个磁分析器组成，静电分析器允许有某个能量的离子通过，并按不同能量聚焦，先后进入磁分析器，经过两次聚焦，大大提高了分辨率。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 离子阱检测器(iontrap detector) /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　原理类似于四极分析器，但让离子贮存于井中，改变电极电压，使离子向上、下两端运动，通过底端小孔进入检测器。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　检测器的作用是将离子束转变成电信号，并将信号放大，常用检测器是电子倍增器。当离子撞击到检测器时引起倍增器电极表面喷射出一些电子，被喷射出的电子由于电位差被加速射向第二个倍增器电极，喷射出更多的电子，由此连续作用，每个电子碰撞下一个电极时能喷射出2~3个电子，通常电子倍增器有14级倍增器电极，可大大提高检测灵敏度。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 真空系统 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　由于质谱仪必须在真空条件下才能工作，因此真空度的好坏直接影响了气质联用仪的性能。一般真空系统由两级真空组成，前级真空泵和高真空泵。前级真空泵的主要作用是给高真空泵提供一个运行的环境，一般为机械旋片泵。高真空泵主要有油扩散泵和涡轮分子泵，目前主要应用的是涡轮分子泵 /p p style=" line-height: 1.5em " 　 strong 　主要性能指标 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　气质联用仪的整体性能指标主要有以下几个：质量范围、分辨率、灵敏度、质量准确度、扫描速度、质量轴稳定性、动态范围。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　质量范围指的是能检测的最低和最高质量，决定了仪器的应用范围，取决于质量分析器的类型。四极杆质量分析器的质量范围下限1~10，上限500~1200。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　分辨率是指质谱分辨相邻两个离子质量的能力，质量分析器的类型决定了质谱仪的分辨能力。四极杆质量分析器的分辨率一般为单位质量分辨力。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　灵敏度：气质联用仪一般采用八氟萘作为灵敏度测试的化合物，选择质量数272的离子，以1pg八氟萘的均方根(RMS)信噪比来表示。灵敏度的高低不仅与气质联用仪的性能有关，测试条件也会对结果产生一定影响。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　质量准确度为离子质量测定的准确性，与分辨率一样取决于质量分析器的类型。四极杆质量分析器属于低分辨质谱，质量准确度为0.1u。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　扫描速度定义为每秒钟扫描的最大质量数，是数据采集的一个基本参数，对于获得合理的谱图和好的峰形有显著的影响。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　质量轴稳定性是指在一定条件下，一定时间内质量标尺发生偏移的程度，一般多以24h内某一质量测定值的变化来表示。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　动态范围决定了气质联用仪的检测浓度范围。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 测定方法 /strong /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 总离子流色谱法(totalionization chromatography，TIC) /strong --类似于GC图谱，用于定量。l反复扫描法(repetitive scanningmethod，RSM)--按一定间隔时间反复扫描，自动测量、运算，制得各个组分的质谱图，可进行定性。l质量色谱法(masschromatography，MC)--记录具有某质荷比的离子强度随时间变化图谱。在选定的质量范围内，任何一个质量数都有与总离子流色谱图相似的质量色谱图。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 选择性离子监测(selectedion monitoring，SIM) /strong --对选定的某个或数个特征质量峰进行单离子或多离子检测，获得这些离子流强度随时间的变化曲线。其检测灵敏度较总离子流检测高2~3个数量级。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　 strong 质谱图 /strong --为带正电荷的离子碎片质荷比与其相对强度之间关系的棒图。质谱图中最强峰称为基峰，其强度规定为100%，其它峰以此峰为准，确定其相对强度。 /p p br/ /p