小鼠气管插管平台

生命科学研究过程离不开各类科学仪器的帮助，仪器信息网特别策划话题：“生命科学技术平台经验分享” ，邀请高校、科研院所公共技术平台的老师分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解相关技术进展，学习仪器使用方法。本篇为北京大学天然药物及仿生药物全国重点实验室李文哲博士供稿。双光子吸收的理论概念是1931年由德裔美国物理学家Maria Göppert-Mayer在她的博士论文中提出。到1960年，激光器被发明出来后双光子吸收在实验上被验证，但是直到1990年第一台双光子荧光显微镜才被美国康奈尔大学的Denk、Strickler和Webb开发出来，Denk很快就将双光子显微镜用于神经元成像。1997年，美国科学家Svoboda利用双光子显微镜测量完整老鼠大脑的锥体神经元，并记录其感官刺激诱导树突钙离子动态，自此双光子显微镜的潜能开始完全凸显。时至今日，双光子显微系统在神经科学、肿瘤学、心脑血管及药物研究等领域有了极大的发展，近年来，光遗传光刺激也更多地和双光子技术结合，广泛地应用于清醒小动物领域。双光子成像的原理和优势特点双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。图1.双光子激发原理（左）及双光子吸收现象（右）从双光子现象的原理，我们可以总结出双光子成像的特点及其相对于共聚焦成像的优势：1.光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对活体细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的活体研究；2.穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力（图2），因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题，常规情况下，共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米；3.高分辨率：同时吸收两个光子意味只有高强度聚焦点处能被激发，由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收仅局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；4.荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦针孔），这样就提高了对荧光的收集率；5.图像对比度高：由于双光子激光波长较长，瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，大大降低了散射的干扰（图2）；6.避免组织自发荧光的干扰，获得较强的样品荧光：生物组织中的自发荧光物质的吸收波长一般在350-560nm范围内，采用近红外或红外波段的激光作为光源，能大大降低生物组织对激发光吸收（图2）。图2. 不同波长下的光穿透深度、光散射以及内源性物质对光的吸收情况基于以上优势，双光子显微镜自发明30年来，已成为较厚组织及活体动物显微成像中不可或缺的工具。我们平台双光子显微镜常用的应用研究如，在神经科学领域用于脑神经和脑血管成像，通过开颅对麻醉小鼠完整V层锥体神经元和更深层的海马神经元的三维结构进行深层成像，对脑血管进行高速动态实时成像；在肿瘤研究中，对于肿瘤细胞及肿瘤微环境中免疫细胞的行为进行成像；在药物研究中，对于药物在肿瘤或脏器中的靶向、释放及代谢等动力学行为进行实时可视化成像；得益于平台双光子显微镜双脉冲激光（一根700-1300nm可调激光，一根1040nm固定谱线激光）的配置，可进行双通道同时成像，特别是适用于比率型荧光生物传感器的研究，如果利用一根激光作为刺激光源，可进行边刺激边成像实验。双光子显微成像的“搭档”双光子显微镜用于活体动物的原位显微成像，为保证实验动物在成像时保持稳定且维持正常的生理状态，往往需要搭配一些辅助成像的设备或者配件。以下为我们常用的几种双光子成像辅助配件：1、可移动麻醉机进行双光子活体动物成像实验时，为保持动物处于稳定状态，需对其进行持续麻醉。吸入式麻醉起效快，麻醉效果稳定，麻醉的深度和维持时间易控制，麻醉撤离后动物复苏快，最重要的是其不会影响动物的生理指标，被认为是啮齿类动物最可靠的麻醉方式。异氟烷气体吸入式麻醉是目前国际惯用的麻醉方式，研究表明，异氟烷麻醉能维持动物的心率、血氧分压、血液pH等生理功能处于稳定状态，适合情况复杂且持续时间较长的动物实验，包括对小动物进行连续成像。因此小动物可移动麻醉机是双光子显微成像实验中必不可少的辅助设备。本平台配备的小动物可移动麻醉机适用于大鼠、小鼠、豚鼠，可保证动物在成像的同时进行可控的持续麻醉。2、小动物成像视窗由于光吸收和光散射，目前双光子成像深度≤1 mm。因此对于活体动物器官的成像一般需手术暴露成像部位。众所周知，大多数的生理和病理过程发生在较长时间内，需连续几天或更长时间内对同一只动物多次成像。因此对于双光子活体成像，待观察组织的暴露及固定技术非常重要。此外，正置双光子显微镜常用水镜，小鼠活体成像过程中会因稳定性不足发生抖动，造成样品与物镜间的水缺失，而活体动物自身的呼吸和心跳等影响因素也会造成成像焦面的丢失，一旦失焦，重新进行对焦十分耗时，大大影响成像的效率。基于以上问题，对于动物成像部位的维持与固定有非常高的要求，固定装置不能对动物有太大的损伤，既要保证能够得到清晰的图像，还要保证动物生命体征正常。目前已有多项研究通过构建和使用双光子活体成像窗口，实现对不同脏器进行固定和长期成像，其中脑部颅骨薄窗成像技术较为成熟，因其远离心脏的位置优势，前处理和固定相对较容易，结合荧光标记物已广泛应用于脑神经科学相关研究。腹部器官如肝脏、淋巴组织、肠、脾脏和肾等都很软且血管密布，由于解剖位置不同，缺乏可以固定成像窗的骨骼结构，给窗口适配器的固定增加了难度；而且腹部脏器普遍离心脏较近，拉伸距离有限，更需要较好的固定和麻醉来抵抗心跳造成的图像抖动。因此腹部器官的活体成像更具挑战性，固定适配器往往需根据具体实验自制或定制。3、气管插管工具及呼吸机对于小动物肺部成像或心脏成像，需对其进行开胸手术，为维持动物正常的生理活性，满足呼吸代谢的需求，一般借助呼吸机对其进行有节律的肺部供气。呼吸机的本质就是一种气体开关，控制系统通过对气体流路的控制而完成给实验动物肺部供气，保持实验动物生理活性的设备。而气管插管是呼吸机辅助呼吸的重要步骤，顺利的气管插管是实验成败的关键之一。气管插管（以下简称插管）是指将一特制的气管内导管经声门置入气管，进而打开小动物呼吸道，为气道通畅、通气供氧等提供最佳条件。气管插管推荐使用静脉留置针的套管，大鼠一般使用16-18G套管，小鼠一般使用22-24G套管。我们平台一般使用光纤辅助法经口插管，操作过程中先将动物固定到一个倾斜的平板上，光纤插入到气管插管中，然后利用这种带光源的气管插管在明视野条件下经口腔插入动物的气管，然后拔掉光纤，用专用的气泡接到气管插管中，吹泡检测是否气管插管到达需要的位置，如果确认插管到位，再将气管插管与呼吸机的Y型接口相连。光纤辅助法也是目前插管最快，成功率最高的方法，同时对动物的损伤小，对操作人员的技能要求低。国产双光子显微镜的现状和未来双光子显微镜目前已广泛应用于神经科学、肿瘤研究、免疫学、病毒学、化学生物学等研究领域，在基础科研和临床前研究中都有着不可替代的重要地位。一流的科研离不开一流的技术，但由于我国在显微镜行业起步较晚，当前我国高端双光子显微镜市场仍大多依赖进口，深度精密制造、光学核心部件设计及工艺严重制约产业升级，国内具备生产高端显微镜的企业屈指可数，必须承认的是国内厂商仍与国际高端水平有相当差距，在国际竞争中技术上处于相对劣势。我们平台的高端显微镜目前全部为进口品牌，在使用过程中一旦出现核心部件的严重的故障，涉及到需要连线国外厂家维修和维权非常不顺畅，耗费大量的人力和时间成本，严重影响了科研进度，面对此困境，国产高端显微镜的自立自强迫在眉睫。令人欣喜的是，近几年在国家科研仪器专项的支持下，我国科研仪器行业迅猛发展，特别是高端显微镜研制已渐入佳境，近几年更是研究出了有自己特点的高端双光子显微镜。中国科学院苏州医工所推出的“中科希莱”品牌高速双光子荧光显微镜深入研究并掌握了基于12kHz共振扫描器和磷砷化镓探测器的高速高灵敏度在体双光子成像技术，开发了专用于生物在体成像的高速高分辨双光子显微镜系统，实现了深表层和高速神经功能成像，并能与电生理、光遗传等常用生理仪器完全同步联合运作。目前产品已销售到以色列耶路撒冷希伯来大学、北京大学分子生物研究所、中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所等国内外多家高校及研究所。2017 年，北京大学程和平院士牵头研发的微型化双光子活体成像技术的出现，使目前最新神经科学需要的针对清醒动物的功能研究实验得以实现，其核心技术 2.2 克可佩戴式微型化双光子荧光显微镜，在国际上首次获取了小鼠自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰稳定的图像。该成果获得了中国科技部评选的2017年度“中国科学十大进展”，同时与其他自由运动成像技术被Nature Methods杂志评为2018年度方法——“无限制行为动物成像”。2021年，该团队在Nature Methods上报道了第二代微型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM 2.0，其成像视野是该团队于2017年发布的第一代微型化显微镜的7.8倍，同时具备三维成像能力，获取了小鼠在自由运动行为中大脑三维区域内上千个神经元清晰稳定的动态功能图像，并且实现了针对同一批神经元长达一个月的追踪记录。目前该技术已产品化并销往海内外，销售额过亿。值得一提的是，2023年2月27日，该团队研制的空间站双光子显微镜随神舟十五号进入太空，航天员乘组使用空间站双光子显微镜开展在轨验证实验任务，成功获取航天员皮肤表皮及真皮浅层的三维图像，为未来开展航天员在轨健康监测研究提供了全新工具。近五年来，国产高端显微镜科技成果产业化的飞速进步给了我们很多惊喜，也在逐渐努力打破当前被进口仪器垄断的市场格局。但由于我国显微镜行业起步较晚，发展缺乏技术沉淀，因此在核心部件设计、工艺及精密制造上仍与国外拥有百年历史的显微镜厂商有较大差距。未来，随着国内显微镜仪器行业新产品层出不穷，对光学元件组件加工技术（如光学玻璃非球面加工技术）、配套材料及高精度检测技术要求越来越高，只有解决了这些问题，才能将高端显微镜的知识产权和核心技术牢牢掌握在自己手里，以期真正实现高端显微镜的自主创新和国产替代。关于北京大学天然药物及仿生药物全国重点实验室生物影像平台在科技部国家重点实验室仪器专项和双一流学科建设经费的支持下，实验室建立了配套齐全、设备先进的大型仪器研究技术平台，设备总值约3.6亿元，按功能分为10个子平台，可为生物医学研究和新药研发提供全链条技术支持。其中，生物影像平台技术精专、设备一流、开放性强、是一个为科研人员提供合作研究和技术交流的多功能研究技术平台。生物影像平台拥有成熟的高内涵成像分析技术、STED/STORM/Airyscan超高分辨成像技术、共聚焦成像技术、双光子成像技术、多光谱全景组织切片成像及表型分析技术、小动物光学成像技术、多模式小动物光/超声成像技术等，同时平台集成了Imaris、Aivia、inForm、Nis-element、AutoQuant X3等多种智能图像处理分析软件，建立完备的图像分析工作站，获取大量基于图像的生物信息分析数据。平台成功建成从分子到细胞、组织、动物完整的生物成像及分析体系，已广泛应用于校内外的分子及细胞生物学研究、免疫学研究、疾病研究、原创药物研发及高通量药物筛选、新型纳米功能材料研究等领域。主持多项国家级课题和校级技术类开放课题，不断开发或拓展成像技术的应用领域，积累了丰富的生物成像研究经验。本成像平台目前的研究方向及技术服务内容有：1. 核酸、蛋白、糖类等生物分子的成像及相互作用分析；2. 细胞生物学成像及细胞器的动态相互作用超高分辨成像与分析；3. STED、STORM、Airyscan超分辨成像技术；4. FRET、FRAP、TIRF等成像技术及分析；5. FLIM、FLIM-FRET、FCS成像及定量分析；6. 信号传导通路分析及分子定位分析；7. 细胞内药效学及药物动力学可视化评价；8. 组织病理切片制备、染色、免疫组化、多色免疫荧光；9. 组织切片全景扫描、多色免疫组化荧光成像与空间组学分析；10.双光子小动物活体原位细胞动态成像；11. 小动物活体光学/超声/光声成像及活体中的药效、药物动力学评价等。

7月7日，某招标采购网站上发布海南大学采购激光共聚焦显微镜、高内涵成像系统、流式细胞仪等仪器的项目，项目总计金额超过1180万元。其中全自动生化分析仪，二氧化碳培养箱到水浴箱要求为国产。以下为详细招标信息：招标单位:海南大学招标产品:液相色谱质谱联用仪 ,石英晶体微天平 ,切片机 ,水浴/油浴/恒温槽 ,移液器/移液枪 ,共聚焦显微镜 ,生物显微镜 ,流式细胞仪/细胞分析仪 ,动物麻醉机 ,生化分析仪 ,液氮罐 ,生物安全柜 ,CO2培养箱/二氧化碳培养箱 ,血液分析系统 招标编号:HD2022-1-027流式细胞分析仪等招标公告招标编码为【HD2022-1-027】，招标项目内容包括【流式细胞分析仪、激光扫描共聚焦显微镜、高内涵筛选系统、全自动生化分析仪、移液器、液相色谱/三重串联四极杆质谱联用系统、全自动模块式动物血液体液分析仪、电子天平、生物显微镜、二氧化碳培养箱、生物安全柜、小动物麻醉机、液氮罐、水浴锅、切片机】，投标截止到【2022-07-26 08:30】，欢迎合格的供应商前来投标。项目编号：HD2022-1-027项目名称：药学院美安实验平台设备购置一、采购需求：包号采购品目名称数量预算（万元）A激光扫描共聚焦显微镜1260B高内涵筛选系统1265流式细胞分析仪198.8C超高效液相色谱/三重串联四极杆质谱联用系统1260D全自动模块式动物血液体液分析仪170全自动生化分析仪131.5E自发行为记录分析系统127F包：171.35 万元序号采购品目名称数量预算（元）1全自动脱水机13120002石蜡包埋机11840003全自动石蜡切片机12090004倒置显微镜1990005体视显微镜1620006生物显微镜1960007二氧化碳培养箱2398008生物安全柜3395009双开门冰箱2450010灭菌锅14200011烘箱1580012显微镜17500013台式低速离心机2750014水浴锅2180015掌上离心机5160016涡旋仪2120017液氮罐2780018防爆柜1450019大容量离心机22000020培养箱12000021二氧化碳培养箱12000022生物安全柜13500023小动物麻醉机23500024小动物呼吸机22500025大小鼠耳标钳3100026大鼠脑模具2300027小鼠脑模具2300028大鼠心模具2350029小鼠心模具2350030大鼠气管插管套装2230031小鼠气管插管套装2210032小鼠固定装置650033大鼠固定装置650034兔固定装置1030035犬固定装置3400036小型无影灯11000037消毒喷雾机5100038电子天平（1g）250039电子天平（0.1g）3100040电子天平（0.001g）1400041电子台秤（10g）2200042电子体温计410043电子数显游标卡尺1100044冰箱（4度）11190045冰箱（-20度）11060046冰柜（-20度）1980047单道可调量程移液器1170048单道可调量程移液器1170049单道可调量程移液器1170050单道可调量程移液器1170051单道可调量程移液器1170052单道可调量程移液器1170053电动移液器1280054水浴箱15000包D中的全自动生化分析仪，包F中的二氧化碳培养箱到水浴箱国产，其余允许进口。本项目不接受联合体投标。合同履行期限： 非进口产品合同签订后30天内交货且安装调试完毕，进口产品合同签订后90天内交货且安装调试完毕。二、申请人的资格要求：1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定 2.本项目的特定资格要求：1、如投标人不是所投产品生产厂家的，属于三类医疗器械的须具有医疗器械经营许可证，属于二类医疗器械的须具有医疗器械经营备案凭证 2、所投产品属于二、三类医疗器械产品的须具有医疗器械注册证、医疗器械生产许可证(若所投产品为进口产品，则无需提供医疗器械生产许可证) 属于一类医疗器械产品的须具有产品备案登记凭证、生产企业备案登记凭证(若所投产品为进口产品，则无需提供生产企业备案登记凭证)。三、获取招标文件时间： 2022年07月06日00时00分 至 2022年07月12日23时59分(提供期限自本公告发布之日起不得少于5个工作日)(北京时间，法定节假日除外)。地点：全国公共资源交易平台(海南省)(http://zw.hainan.gov.cn/ggzy/)方式： 网上购买售价： 0元四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点2022年07月26日08时30分(北京时间) 地点： 海南省公共资源交易服务中心(海口市国兴大道9号)202 开标室。五、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名 称：海南大学企业信息 地 址：海南省海口市美兰区人民大道58号联系方式：赵老师0898-662790302.采购代理机构信息名 称：中科高盛咨询集团有限公司地 址：海南省海口市龙华区金贸中路1号半山花园海天阁第32层3238房联系方式：蔡广杰0898-685910773.项目联系方式项目联系人：蔡广杰电 话：0898-68591077六、采购项目需要落实的政府采购政策：《政府采购促进中小企业发展管理办法》、《财政部印发通知进一步加大政府采购支持中小企业力度》、《财政部 发展改革委 生态环境部 市场监管总局关于调整优化节能产品、环境标志产品政府采购执行机制的通知》、《关于信息安全产品实施政府采购的通知》、《关于促进残疾人就业政府采购政策的通知》、《财政部 司法部关于政府采购支持监狱企业发展有关问题的通知》、《关于政府采购支持绿色建材促进建筑品质提升试点工作的通知》、《财政部国务院扶贫办关于运用政府采购政策支持脱贫攻坚的通知》、《海南省财政厅关于印发《海南省绿色产品政府采购实施意见(试行)》的通知》、《海南省财政厅 海南省工业和信息化厅关于落实超常规举措加大对中小企业政府采购支持的通知》。

据《科学进展》杂志2日在线报道，美国莱斯大学的生物工程师表示，他们使用针头大小的可植入“药物工厂”持续提供高剂量白细胞介素-2，在短短6天内根除了小鼠体内的晚期卵巢癌和结直肠癌。该疗法或在今年晚些时候开始人体临床试验。白细胞介素-2是一种可激活白细胞以对抗癌症的天然化合物。试验使用的药珠可通过微创手术植入，每个都含有可产生白细胞介素-2的细胞，这些细胞被包裹在保护壳中。莱斯大学生物工程助理教授奥米德魏瑟的实验室研发了这种治疗方法。他说，人体临床试验最早可能在今年秋天开始。该团队只选择了已证明可安全用于人体的成分，并在多项测试中证明了新疗法的安全性。魏瑟说：“我们只给一次药，但‘药物工厂’每天都在生产药物，直到癌症被消除。一旦确定了正确的剂量，即需要多少家‘药物工厂’，我们就能够根除全部的卵巢癌和7/8的结肠直肠癌。”在新发表的研究中，研究人员将产生药物的珠子植入在肿瘤旁边和腹膜内，腹膜是一种支持肠道、卵巢和其他腹部器官的囊状内层，植入的白细胞介素-2集中在肿瘤内，并限制在其他地方暴露。该研究合著者、美国MD安德森癌症中心妇科肿瘤学和生殖医学教授埃米尔贾再瑞博士说：“免疫治疗领域的一个主要挑战是增加肿瘤炎症和抗肿瘤免疫，同时避免细胞因子和其他促炎药物的全身副作用。在这项研究中，我们证明了‘药物工厂’可在几种小鼠模型中进行可调节的白细胞介素-2局部给药和根除肿瘤。”白细胞介素-2是一种细胞因子，一种免疫系统用来识别和对抗疾病的蛋白质。这是一种FDA批准的癌症治疗方法，但研究人员表示，与现有的白细胞介素-2治疗方案相比，“药物工厂”引发了更强的免疫反应，因为药珠直接提供更高浓度的蛋白质到肿瘤。研究人员称：“如果你通过静脉注射泵给予相同浓度的蛋白质，那将是剧毒的。而对于‘药物工厂’，我们在远离肿瘤部位的身体其他部位观察到的浓度，实际上低于患者在接受静脉注射治疗时必须承受的浓度，高浓度仅处于肿瘤部位。”药珠的外壳保护其产生细胞因子的细胞免受免疫攻击。外壳由被免疫系统识别为异物但不视为直接威胁的材料制成。研究团队发现，异物反应在30天内“安全而有力”地关闭了胶囊中细胞因子的流动。如果有必要，可进行第二个疗程。总编辑圈点“药物工厂”可放置在肿瘤旁边，围绕在这些器官和大多数其他器官的内膜内。如果医生需要不同的细胞因子来靶向特定形式的癌症，还可在药珠上装载工程细胞，制造相关免疫治疗的化合物。更值得欣喜的是，这一方法未来将不局限于文中的两种癌症，也可用于治疗胰腺癌、肝癌、肺癌和其他器官的癌症。