色谱质谱定量分析

在现代分析化学领域，毛细管气相色谱技术因其分离效率和精确的分析能力而被广泛应用。尤其在面对组成复杂的样品时，毛细管气相色谱仪显示出其优势。本文将深入探讨它在处理复杂样品时的定性和定量分析能力，以及其在实验过程中的应用策略和注意事项。 　　毛细管气相色谱仪的核心部分是长而细的毛细管柱，内壁涂有固定相。这种设计极大地增加了相互作用的表面积，使得样品分子能在气相和固定相之间进行成千上万次的交互作用。通过精准控制色谱条件如载气流速、温度程序等，可以实现复杂混合物中各组分的有效分离。 　　在进行定性分析时，毛细管气相色谱通常与质谱（MS）或傅里叶变换红外光谱（FTIR）联用，以增强识别未知化合物的能力。例如，气相色谱-质谱联用技术可以提供样品中每个峰的质谱图，通过数据库比对实现快速鉴定。这种方法尤其适用于石油产品、植物提取物、香精香料等复杂样品的分析。 　　定量分析方面，仪器通过与标准物质的保留时间和峰面积或峰高对比，实现高精度的定量测定。使用内标法或外标法定量，可以根据实际需要选择最合适的方法。内标法通过添加已知浓度的内部标准物来校正样品处理过程中可能出现的损失，从而提高定量的准确性。外标法则依赖于标准曲线，适用于可以精确控制样品进样量的情况。 　　操作时，需特别注意温度的控制和优化。升温程序必须精心设计以确保所有组分都能得到有效分离而不致于峰展宽或峰形失真。载气的选择和流速的调整也至关重要，氮气和氦气是常用的载气，它们具有化学惰性，不会与样品发生反应。 　　维护和日常检查对于保持设备的最佳性能也是必要的。定期检查和更换进样口的隔垫、衬管和色谱柱，可以防止样品交叉污染并保证分析的重现性。 　　综上所述，毛细管气相色谱仪是分析复杂样品的强有力工具。通过优化分析条件和适当的操作维护，可以实现对复杂样品中各个组分的高效、准确的定性和定量分析。

样品流路中分析物与金属表面相互作用引起的金属吸附是寡核苷酸分析中的主要问题之一。使用传统的 LC系统（基于不锈钢材质）通常会导致峰形不佳、灵敏度和定量性能受损。本文介绍了使用为解决金属吸附问题而开发的 Nexera XS inert系统分析寡核苷酸的示例。对灵敏度、定量性能和残留进行了评估，结果显示，与在流路中使用不锈钢的 HPLC 系统相比，该生物惰性系统在整体性能上明显改善。Nexera XS inert系统对金属配位化合物表现出优异的分析性能。通常用于 HPLC 流路的不锈钢 (SUS) 具有出色的耐压性，但含有磷酸基团的化合物可以通过金属配位作用与润湿不锈钢表面吸附。金属吸附会对峰形、检测灵敏度和重现性产生负面影响，并降低定量分析的性能。一般通过重复注入高浓度样品来抑制吸附，但这种方法既费时又昂贵。另一种方式是使用含有螯合剂的溶液来抑制吸附。但是此方法不适用于 LC/MS 分析，因为它可能导致污染和灵敏度降低。为了评估金属吸附抑制效果，采用常规HPLC系统（Nexera XR）和生物惰性UHPLC系统（Nexera XS inert）进行分析，并分别使用不锈钢色谱柱和无金属色谱柱。寡核苷酸的反相色谱分析中通常采用离子对试剂，本实验中使用HFIP（1, 1, 1, 3, 3, 3-六氟-2丙醇）和DIPEA（N, N-二异丙基乙胺）。样品信息：序列：5'-dG-dC*-dC*-dT-dC*-dA-dG-dT-dC*-dT-dG-dC*-dT-dT-dC*-dG-dC*-dA-dC* -dC*-3'，(*) 表示 5-C 或 5-U 甲基化 (d) 2'-脱氧核苷分子量：6431.72色谱及质谱条件：略。图 1 显示了使用 Nexera XR 和不锈钢色谱柱以及 Nexera XS inert和无金属色谱柱分析的 10 ng/mL 标准寡核苷酸溶液的色谱图。与 Nexera XR 相比，Nexera XS inert 的峰强度增加了约 1.7 倍。图1 寡核苷酸标准溶液(10 ng/mL)的MRM色谱图图2 (a) Nexera XR，(b)Nexera XS inert 交叉污染比较分析浓度为1000 ng/mL的寡核苷酸溶液后，立即将样品溶剂水作为空白进样以评估残留情况。图2（a）显示了Nexera XR空白分析的色谱图，图2（b）显示了Nexera XS inert空白分析的色谱图，可以看到两者的残留水平分别为0.0790%和0.0033%。这些结果表明，Nexera XS inert系统显著抑制了金属吸附并最大限度地减少了交叉污染。样品流路中分析物与金属表面相互作用引起的金属吸附是寡核苷酸以及其他金属敏感化合物分析中的主要问题之一。Nexera XS inert在样品接触流路中使用生物惰性材料，对易被吸附的化合物具有出色的峰形、分离度、灵敏度、重现性和定量性能。而且，该系统耐压超过100MPa，适用于超快速分析，显著提高实验室分析通量。Nexera XS inert系统与MS的结合是分析金属敏感化合物的理想解决方案。本应用中使用的仪器（Nexera XS inert+LCMS-8060）参考文献：1、LCAV-0001-0274，Improvement of Quantitative Performance in LC/MS Analysis of Oligonucleotides using Nexera XS inert本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

多肽药物是介于大分子蛋白/抗体类药物和小分子药物之间的一 类重要的药物分子，因其生物活性高、靶向专一性高、选择性 高、毒副作用低等优点而被广泛应用于疾病治疗领域[1]。Ther mo Obitrap因其超高的分辨率，质量轴稳定性，已经广泛应用 在了多肽药物结构表征中。Obitrap 作为高分辩还具有极高灵敏 度和线性范围，因此也被越来越多的应用到药物的定量研究中。　　PTH 是甲状旁腺主细胞分泌的由84个氨基酸组成的多肽类 激素，其对于维持钙磷代谢的稳定起着至关重要的作用。 特立帕肽（SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV HNF，4117.7 Da）是一种人工重组合成的人PTH 1-34多 肽，是第一个被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的抗骨质疏松性骨折的骨合成药物。 Thermo Scientifific Q Exactive Focus 四极杆 Orbitrap 组合型质 谱仪专为常规分析应用而设计，最高分辨率为7万，最大分辨 率12Hz，可以在同一系统中同时实现准确可靠的定性和定量分析。　　Obitrap Fusion Lumos是赛默飞世尔科技在2015年推出的三合 一的静电场轨道阱超高分辨质谱仪。Lumos搭载的分段式四级 杆技术（Advanced Quadrupole Technology，AQT）使离子传 输效率至少提高了 2 倍，超高场的Obitrap拥有50万分辨率和 20Hz的超快扫描速度，使Lumos在具有极佳的灵敏度同时，还 拥有稳定性和动态范围。　　本实验将基于两款Obitrap高分辩质谱Q Exactive Focus和Obit rap Fusion Lumos建立多肽药物特立帕肽的定量分析方法，考 察高分辩质谱Obitrap的定量能力。　　实验结果　　1、特立帕肽标准品在Focus，Lumos上的线性与准确度。　　用稀释剂（含0.1ug/μL BSA，1% FA，5% ACN）的稀释剂逐级 稀释特立帕肽标准品，配置成一系列浓度标准品，上样分析。 结果表明，Focus对特立帕肽的定量下限为50 pg/mL， 上样5μL，上柱约60 amol，标准曲线线性良好，R2=0.997，标 准曲线各点回算的浓度在理论值的15%以内。　　特立帕肽的LOQ点在Focus和Lumos上的提峰图如图，峰型良 好，信噪比S/N10，重复5针的RSD10%，表现出了 良好的稳定性。图 Focus，Lumos上LOQ的峰图　　2、特立帕肽血浆样品在Lumos上的线性与准确度。　　 同时在Lumos上考察了特例帕肽血浆样品的定量下限。取150 μL的空白人血浆，加入一系列浓度梯度的特立帕肽标准品，配 置成血浆标曲，用1:6体积的75% 乙腈沉淀后，离心去上清， 挥干，复溶后进样。 结果显示，Lumos对于基质复杂的血浆样品仍表现出良好的线 性，精密度，稳定性。特立帕肽最低定量下限为50 pg/mL，线 性范围50 pg/mL-50 ng/mL，1000倍的线性范围，上柱 量约60 amol，标曲各点Diff值 10%。　　结论 本文分别在Obitrap Focus，Lumos上建立了大分子多肽类药物 特例帕肽的定量分析方法。结果表明，高分辩Obitrap对特立 帕肽表现出良好的定量能力，定量下限可以分别达到上柱60 amol，24 amol。同时，对于基质更为复杂的血浆样品，Lumos 上可以达到定量下限上柱60 amol，灵敏度满足临床上对特立帕 肽的检测要求。Obitrap作为高分辨质谱，在拥有超高分辨率的 同时，兼具出色的灵敏度和稳定性，可以应用大分子多肽类药 物的定量分析与检测。