液相色谱定量环进样量

四川大学欲采购两台超快速液相色谱仪，其中，超快速液相色谱仪A，预算单价499900元，需要搭配蒸发光散射检测器一套，主要用于蛋白质药物和小分子药物的辅料测定、杂质分析等；超快速液相色谱仪B，预算单价499900元，需要搭配双波长紫外检测器和全波长荧光检测器各一套，主要用于蛋白质药物和小分子药物纯度分析、含量测定、杂质分析等。详细信息如下所示：超快速液相色谱仪A（一）主要用途用于蛋白质药物和小分子药物的辅料测定、杂质分析等。（二）配置要求1 四元梯度泵（包括四元梯度泵系统、柱塞杆自动清洗装置、四通道在线真空脱气机） 1套2 自动进样器 1套3 智能柱温箱 1套4 蒸发光散射检测器 1套5 色谱软件许可 1套6 其它配置：色谱柱1支，样品瓶1盒，溶剂瓶6个。7 验证IQ/OQ/PQ，1套（三）技术参数1 工作环境：1.1 环境温度：摄氏10-40度.1.2 环境湿度：20-80%.1.3 电压：100-240V2 性能指标2.1 四元梯度泵系统2.1.1 工作模式：相互独立、电子控制的双柱塞直线驱动装置，双压力传感器反馈回路控制压力并进行脉冲抑制。2.1.2 泵压力传感器反馈回路：≥2路/泵，提供设备硬件构造图予以证明。2.1.3 混合方式：低压混合，四元梯度2.1.4 流动相溶剂数：4路2.1.5 最大操作压力：9500 psi2.1.6 柱塞清洗：标配自动柱塞清洗装置，可编程2.1.7 梯度模式：11种或以上梯度曲线，由色谱软件实现准确控制，提供软件实际操作界面截图予以证明2.1.8 流速范围：0.001-5.000ml/min，以0.001ml为增量2.1.9 流速精度：2.1.11 梯度准确度：± 0.5%，不随反压变化2.1.12 梯度精度：± 0.15%RSD或±0.02min SD，不随反压变化2.1.13 延迟体积：2.2.2 进样次数：每个样品1 - 99次进样2.2.3 进样精度：0.9992.2.5 *样品交叉污染：2.2.6 洗针方式：针内外每次进样后通过专用流路自动清洗2.2.7 进样体积：0.1- 30ul，增量为0.1ul2.3 蒸发光散射检测器2.3.1 雾化器：前面板预装配，卡口式设计2.3.2 漂移管温度：5-100℃，0.1℃增量2.3.3 *雾化器三种温度控制模式：加热、常温、冷却2.3.4 雾化器气体种类：氮气、空气2.3.5 雾化器压力：20~60 psi2.3.6 雾化器气流量：300~3000 ml/min2.3.7兼容液体流量：3.000 mL/min，100%水2.3.8 信号范围：0.1~2000光散射单位2.3.9 光源：卤钨灯，寿命2000小时2.3.10 采样频率：80 Hz2.4 色谱软件2.4.1 最新Windows 10操作系统下编写和测试。2.4.2 原厂源代码级全中文版，其中包括在线帮助采用简体中文。2.4.3 操作向导模式和在线帮助功能：只需按照指南要求进行操作即可执行相应的功能。2.4.4 具有数据安全性：符合cGMP/GLP和21 CFR Part 11法规的要求，具有电子记录，电子签名之功能。具有分配用户使用权限之功能。2.4.5 *≥16种校正拟合定量计算方式，适应不同分析及不同检测器应用。2.4.6 ≥10种数据检索模式，适应大量数据管理和检索。2.4.7 报告格式的编辑和排版：结果可以有单个报告和综合报告。2.4.8 原始数据和结果可通过多种方式输出到其它软件中（如Excel）。超快速液相色谱仪B（一）主要用途用于蛋白质药物和小分子药物纯度分析、含量测定、杂质分析等。（二）配置要求1 四元梯度泵（包括四元梯度泵系统、柱塞杆自动清洗装置、四通道在线真空脱气机） 1套2 自动进样器 1套3 智能柱温箱 1套4 双波长紫外检测器 1套5 全波长荧光检测器 1套6 色谱软件许可 1套7 其它配置：色谱柱1支，样品瓶1盒，溶剂瓶6个。8 验证IQ/OQ/PQ，1套（三）技术参数3工作环境：3.1环境温度：摄氏10-40度.3.2环境湿度：20-80%.3.3电压：100-240V4性能指标4.1 四元梯度泵系统4.1.1工作模式：相互独立、电子控制的双柱塞直线驱动装置，双压力传感器反馈回路控制压力并进行脉冲抑制。4.1.2泵压力传感器反馈回路：≥2路/泵，提供设备硬件构造图予以证明。4.1.3混合方式：低压混合，四元梯度4.1.4流动相溶剂数：4路4.1.5最大操作压力：9500 psi4.1.6柱塞清洗：标配自动柱塞清洗装置，可编程4.1.7梯度模式：11种或以上梯度曲线，由色谱软件实现准确控制，提供软件实际操作界面截图予以证明4.1.8流速范围：0.001-5.000ml/min，以0.001ml为增量4.1.9流速精度：4.2 样品管理系统4.2.1样品瓶位：≥96位4.2.2进样次数：每个样品1 - 99次进样4.2.3进样精度：0.9994.2.5*样品交叉污染：4.3.2带宽：≤5 nm4.3.3波长准确度：±1 nm (使用专利型铒过滤器)4.3.4波长重现性：±0.1 nm4.3.5测量范围：0.0001~4.0000 AU4.3.6检测通道：2个4.3.7基线噪音 单通道：4.3.11采样频率：≤80 Hz4.3.12*流通池：专利型梯形狭缝池，消除示差折光效应4.3.13池长：10 mm（分析池）；池体积：16.3 μL（分析池）4.3.14*固定狭缝：保持良好线性和光谱分辨率，简化操作4.4 荧光检测器

在制备液相色谱中，样品的上样量是影响分离效果的重要因素之一。要纯化分离的样品应以合适的浓度添加到色谱柱柱床上，以实现窄的水平谱带。如果上样量太大，则谱带变宽，分离效率降低。Flash和Prep HPLC的上样量有很大不同。由于Flash色谱通常用于预纯化，高分辨率不是优先考虑的因素，因此上样量往往比Prep HPLC高。在Prep HPLC中，主要目的是获得最高纯度的物质，故基线必须得到分离。正相和反相二氧化硅（如C-18、氨基或二醇基）的上样量也存在相当大的差异。由于非键合相二氧化硅的表面积大，故这种固定相的载样能力更高。正相二氧化硅的载样能力通常比键合二氧化硅的载样量高约10倍。标准二氧化硅（粒径40-60 μm）通常可接受10%的载样量；在使用较小颗粒（15-30μm）时可以达到30%。然而，重要的一点我们要知道，无论是反相还是正相，上样量由样品的复杂程度决定的。对于含有多种化合物的复杂样品，决定其复杂性的因素是纯化目标化合物与其邻近的洗脱组分的分离程度。通常情况下，复杂样品需要少量多次的上样方式来处理。接下来“小步”同学将分享给大家一篇关于Pure制备色谱上样量的应用文章，来让大家感受下色谱的魅力。?在液相色谱中，样品可以通过两种不同的方式上样：固体或液体。液体上样，是将样品溶解在溶剂中后，直接注入色谱柱上。固体上样，是将粗样品与载体材料（如硅胶）的固体均匀混合物放在色谱柱前面。图1：液体和固体样品每种技术都有其需要考虑的特殊方面，下面将进行更详细的讨论。液体上样是一种将样品很好地溶解在洗脱初始溶剂中的方法，可用于Flash和Prep液相色谱应用中。推荐使用弱极性溶剂，因为强极性溶剂会降低分离度。液体上样被认为是最简单、最快捷的方法，但可能会造成样品损失，需要考虑的因素如下：- 化合物在初始溶剂中的溶解度:样品需要完全溶解，因为进样系统或色谱柱顶部的沉淀可能在系统中产生过大的压力，并最终导致样品流失。- 溶解溶剂的极性：如果使用极性溶剂溶解样品，则它们可能会吸附在极性硅胶柱基质上，并对更多极性化合物（后来在硅胶材料上洗脱的化合物）的分离产生不利影响。- 样品溶剂的体积:体积越大，样品从一开始就迁移到填料柱床中的风险就越高，从而导致谱带变宽、分离度降低。理想的样品体积不应超过色谱柱体积的10%。样品的保留率越高，可装载的体积就越大。- 样品量：每根色谱柱都有规定的装载量。理想的样品量不应超过纯化柱的最大装载量。在Flash液相色谱中，通常是在注射器的帮助下将液体样品手动直接注入到色谱柱顶部（如下图）。由于高背压，无法在Prep液相色谱柱上进行手动上样。因此，它是通过专用的进样阀完成的，如图所示：图2：Flash和Prep HPLC中的液体上样固体上样是仅适用于Flash色谱分离应用的技术，用于只能在强溶剂中溶解的样品，或用于具有难以溶解的粘性或多杂质样品。该方法可以通过减少谱带展宽和随后的拖尾效应来改善分辨率。一般来讲，固体上样分离较慢，但与液体上样相比，分辨率更高。推荐的样品量不应超过色谱柱的最大载样量。固体上样通常通过以下步骤完成：- 将粗样品溶解在合适的极性溶剂中。-然后，将该混合物在超声浴中超声几分钟，以提高溶解度。- 过滤混合物以除去尚未完全溶解的物质。非键合的二氧化硅是最常用的吸附剂，但可能不是最佳的选择。通常，建议使用与色谱柱相同类型的硅胶作为支撑材料。这样可以避免不必要的化学相互作用或样品的不可逆吸附。一种有用的替代材料是 Celithe,由于其中性的化学特性，它不与任何物质发生相互作用。

药物分析方法开发共性难点岛津技术团队在与行业用户专家和用户交流中，收集以下共性难点反馈：1、基质化合物组成极性范围宽，色谱峰容量不够。2、中药基质复杂，在对特征峰鉴定时可能受到目标物附近其他峰干扰，影响鉴定准确度。3、聚合物杂质检测通常采用排阻色谱法，对聚合物杂质进行笼统的总量控制，定量不准确，且无法鉴定聚合物杂质的结构。4、采用HPLC-UV法进行杂质测定，但该方法无法将HPLC中使用的不挥发性流动相直接应用到LC/MS分析中，或者流动相与质谱不匹配。针对以上行业分析难点，岛津多年来持续致力于多维色谱质谱联用解决方案开发，将多类型色谱分离优势和质谱分析优势进行结合。岛津多维液相色谱质谱解决方案全二维液质联用系统&中心切割1二维液质联用系统Nexera-e 全二维液相色谱仪《中国药典》0512高效液相色谱法通则：二维液相色谱可以分为差异显著的两种主要类型：中心切割式二维色谱和全二维色谱。中心切割式二维色谱是通过接口将前一级色谱中某一（些）组分传递到后一级色谱中继续分离，面对复杂基质环境时，将一维目标峰切到二维进行更好的分析。全二维色谱是通过接口将前一级色谱中的全部组分连续地传递到后一级色谱中进行分离，如此两个独立的分离模式正交组合可实现尽可能高的峰容量。二维色谱可以是相同的分离模式和类型，也可以是不同的分离模式和类型，二维色谱可以和质谱联用。详情参考：https://www.shimadzu.com/an/products/liquid-chromatography/hplc-system/nexera-e/index.html2全谱二维液质联用系统极性覆盖范围宽:可一针实现宽极性多目标物的同时分析，可以胜任绝大多数分析项目中宽极性、多组分分析的要求。该系统和岛津最新推出的LCMS-9050高分辨质谱正负极离子同时采集功能结合，能得到4in1技术优势--相比岛津前一代方案，可以节省3/4的样品、分析时间，并减少3/4的质谱污染。3 SEC-RPLC-QTOF二维液相色谱-高分辨质谱为了解决前述聚合物杂质鉴定难题，岛津与北京新领先医药科技发展有限公司合作搭建了SEC-RPLC-QTOF二维液相色谱-高分辨质谱检测平台。基于该平台二维杂质动态上样、在线脱盐等技术，以及岛津高分辨质谱仪的高质量准确度和高质量稳定性等性能特点，目前双方的研发人员共同参与完成了十四种β-内酰胺类抗生素的聚合物杂质的全面解析，并建立质谱数据库。详情参考：https://mp.weixin.qq.com/s/etytDIXLjrICzsNfHOKgAw。4 Trap-Free 二维液质联用系统Trap-Free 2DLC系统是一套支持在线流动相转换的二维液相与色谱-质谱联用仪的组合系统，系统结构示意图见图 1。本系统的第一维液相色谱系统，可使用非挥发性流动相或者与质谱分析不匹配的流动相体系，通过系统中切换阀、程序命令的组合,对第一维液相色谱系统分离的组分进行分馏。本系统的第二维液相色谱系统,可以采用适合 LCMS 分析的液相色谱条件，针对分馏的组分，进行针对性的质量分析。详情参考：https://support.shimadzu.com.cn/pdfweb/web/viewer.html?file=https://support.shimadzu.com.cn/an/downa/AP_News_LCMS-QTOF-053.pdf全谱二维液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用分析不同产地当归的活性成分a) 正模式火山图结果 b)负模式火山图结果根据多元统计分析OPLS-DA 结果的 VP 值，可以初步筛选出甘肃产当归和云南产当归的差异活性物质，进一步筛选则通过结合单变量统计火山图结果(P-value 与Fold change) 进行。最终正模式下筛选得到 1351 个差异物质，负模式下筛选得到1716 个差异物质。通过 MSDIAL软件，对化合物进行鉴定，共鉴定出 43种差异性化合物,包括藁苯内酯类有机酸类等天然活性物质，下表为部分差异性化合物鉴定结果表。详情参考：https://support.shimadzu.com.cn/pdfweb/web/viewer.html?file=https://support.shimadzu.com.cn/an/downa/AP_News_LCMS-QTOF-073.pdf岛津携手阳光诺和揭示头孢西丁钠新颖聚合方式图1 头孢西丁钠破坏样品检测色谱图本方案一维采用HPSEC系统，磷酸盐流动相定位头孢西丁钠中的聚合物杂质，然后采用阀切换技术，使用500 μL定量环将聚合物峰全部转移至二维反相色谱，脱盐、分离并质谱鉴定。其中聚合物C1分子量较2分子头孢西丁少2个H（Mr. 852.09），根据其同位素比例和特征碎片离子信息，推断其为一分子头孢西丁7-位侧链与另一分子头孢西丁7-位噻吩环联结形成的，该新颖聚合方式尚未见文献报道。本研究建立了注射用头孢西丁钠聚合物检测的反相色谱方法，并探索其用于日常检验的可能性。C1一级质谱图（A）和母离子m/z 870的二级质谱图(B)（ESI+）详情参考：《Characterization of polymerized impurities in cefoxitin sodium for injection by two-dimensional chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry》.https://doi.org/10.1016/j.talanta.2023.125378二维液相色谱联用四极杆飞行时间质谱仪对赤芍配方颗粒特征图谱2号峰鉴定配方颗粒特征图谱（1D） 配方颗粒特征图谱（2D）一维液相特征图谱中的2号特征峰切入至 50 μL定量环进行收集，再由二维流动相进行洗脱，该组分在二维液相上的保留时间为 35.267 min。采用岛津 2DLC+LCMS-QTOF对赤芍配方颗粒特征图谱中2号特征峰进行了高分辨质谱定性研究。经 MS1、MS2质谱图信息、相关文献信息以及标准品确认，最终鉴定2号特征峰为原花青素 B1。本研究为中药配方颗粒特征成分研究提供了思路，为赤芍中药配方颗粒特征图谱标准制定提供参考依据。Trap-Free 2D LC Q-TOF 定性分析宫缩抑制剂阿托西班中的多聚体杂质阿托西班二聚体的[M+3H]3+峰分子式预测结果 阿托西班二聚体解卷积分析结果阿托西班三聚体的[M+2H]2+峰分子式预测结果 阿托西班三聚体解卷积分析结果针对多肽药物中的由两个或多个多肽组成的稳定的多聚体杂质，可利用体积排阻色谱法(SEC)分离相关杂质。本案例采用岛津Trap-free 2DLC+LCMS-9030，既能避免SEC的色谱条件与质谱离子源不匹配，也能有效解决液相色谱分析浓度过高而导致的质谱信号饱的问题。结果显示阿托西班二聚体和三聚体的 MS1的离子质荷比同理论值均小于1mDa。使用 Insight Explore 软件中解卷积功能预测目标物的分子量，预测分子量和理论分子量的误差小于3ppm。详情参考：https://support.shimadzu.com.cn/pdfweb/web/viewer.html?file=https://support.shimadzu.com.cn/an/downa/AP_News_LCMS-QTOF-053.pdf注：本文中所用数据均为岛津实验室特定条件下的测试数据，结果可能随实际情况变动文中涉及最佳、最低类描述，限于实验组别对比结果。本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。