液相色谱高低浓度分析

近年来,蛋白质组学技术在肽和蛋白质类新型治疗药物的蓬勃发展以及临床新型大分子生物标志物的深入发掘中被日益广泛应用。应用方式的迭代对生物大分子的分析技术提出了更高的要求。基于蛋白质特征肽段检测的自下而上的蛋白质组学技术(bottom up proteomics)是现有研究中具有较高灵敏度与分辨率的蛋白质定性定量方法。开发多肽的生物分析方法是极具挑战的,除了所需的低检出限外,多肽的非特异性吸附性质,使其极易在接触到的材料表面发生吸附,进而导致分析全流程中待测物的丢失或干扰,给定性和定量分析引入巨大风险。例如在蛋白组学研究的质谱数据库搜索中,即使系统中微量肽段的损失或残留亦可能导致假阳性或假阴性结果。而在高灵敏度的多肽定量方法的开发中,肽段的非特异吸附对定量分析的线性、准确度和精密度均有负面影响。低浓度肽段溶液的吸附性质会更加明显,表现形式为标准曲线的非线性,最终导致定量限的不必要升高以及方法的重复性差。已有一些研究在分子水平上解释这种吸附行为,然而目前对其潜在的机制和相互作用仍然知之甚少。Eeltink等基于分子动力学模拟,提出了一种三相分子机制解释肽段从溶液吸附到强相互作用不带电固定相上的原理。Kristensen等研究了样品容器对阳离子多肽吸附的影响,当1 μmoL/L肽溶液在硼硅酸盐或聚丙烯瓶中存储1 h后,肽段的回收率仅有10%~20%。也有研究通过在溶剂中添加有机试剂、酸/碱性溶液、表面活性剂、吸附竞争剂或调整流动相组成等方法减少这类吸附。这些研究论文大多对一组特定的多肽和/或表面材料进行研究,但均未给出可用来预测多肽吸附特性的规律,也未给出通用的解决吸附的方法。本研究选择牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白质,以其酶解后的肽段作为包含亲水性和疏水性多肽的“典型”多肽组样本。首先通过超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)的测定,分析常见多肽理化参数与上述多肽组的非特异吸附程度的关联性。然后基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)建立对强吸附肽段吸附程度的评估方法,从样品制备至分析测定建立全过程试验设计,考察不同材质的制备、储存耗材对肽段吸附的影响,以及考察不同色谱条件对肽段残留的影响,最终提出多肽全流程分析中减少非特异性吸附的通用型策略。01样品制备方法取10 mg BSA溶于10 mL水中,制得1 mg/mL蛋白储备液,进一步以水稀释为100 μg/mL的工作液。取200 μL上述工作液于蛋白质低吸附离心管中 加入65 μL 500 mmol/L碳酸氢铵和60 μL 50 mmol/L二硫苏糖醇,于60 ℃水浴加热60 min对蛋白质进行还原 放冷至室温后加入120 μL 50 mmol/L碘代乙酰胺,于暗处反应30 min进行烷基化 加入100 μg/mL的胰蛋白酶5 μL,于37 ℃水浴中酶解8 h,加入甲酸20 μL终止反应,12000 g离心15 min后,取200 μL上清置于蛋白质低吸附的进样瓶中作为混合肽段溶液待测。02超高效液相色谱-高分辨质谱方法参数色谱条件:色谱柱采用Waters Acquity Premier Peptide CSH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) 柱温为40 ℃ 流速为0.25 mL/min 流动相A、B两相分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为0~1 min, 1%B 1~13 min, 1%B~40%B 13~13.1 min, 40%B~90%B 13.1~16 min, 90%B 16~16.1 min, 90%B~1%B 16.1~20 min, 1%B。进样器温度10 ℃ 进样量5 μL。质谱条件:毛细管电压3 kV,锥孔电压30 V,离子源温度120 ℃,脱溶剂气温度450 ℃,锥孔气流速25 L/h,脱溶剂气流速800 L/h。电喷雾电离(ESI)源、正离子模式下测定,MSE模式采集,扫描范围m/z 50~2000 数据采集时使用亮氨酸脑啡肽校正液进行实时质量校正,以保证采集质量数的准确性与重复性。采集后的数据使用Unifi软件处理。03相对残留量的测定和肽段分级策略将上述混合肽段溶液经上述条件采集、Unifi软件分析后,可得BSA酶解后肽段组的实际肽段组成和每个肽段的响应值Area(供试品溶液)。在进样上述供试品溶液后连续进样3针空白溶剂,以3针空白溶剂中检测到的对应肽段响应之和Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)计为该肽段的残留总量,该肽段的相对残留量为肽段的残留总量与肽段响应值的比值。基于肽段的响应与相对残留量,可将BSA酶解后的肽段组分为如下四类:Class Ⅰ,响应高且无残留的肽段 Class Ⅱ,响应高但有残留的肽段 Class Ⅲ、Class Ⅳ分别为响应低,无吸附和有吸附的肽段。响应的高低以是否大于中位数计,有无残留以Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)是否有检出判断。04超高效液相色谱-三重四极杆质谱方法参数色谱条件:色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C8(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) 柱温30 ℃ 流速0.4 mL/min 流动相A、B两相分别为0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为0~2 min, 2%B 2~5 min, 2%B~60%B 5~5.1 min, 60%B~90%B 5.1~8 min, 90%B 8~8.1 min, 90%B~2%B 8.1~11 min, 2%B。进样器温度10 ℃ 进样量5 μL。洗针液为90%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)。质谱条件:离子化电压5500 V 气帘气压力0.14 MPa 离子源温度500 ℃ 喷雾气、辅助加热气压力0.38 MPa。ESI源正离子模式下测定,多反应监测(MRM)模式采集,12条Class Ⅱ类肽段的离子对、碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)值经Skyline软件协助优化后结果如原文表1所示。文章信息色谱, 2022, 40(7): 616-624 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.12012张莹1,2, 杨静1,2, 马跃新1,2, 曹玲2*, 黄青2*1.南京中医药大学药学院, 江苏 南京 2100232.江苏省食品药品监督检验研究院, 国家药品监督管理局化学药杂质谱研究重点实验室, 江苏 南京 210019

日前，中国政府采购网发布了中国环境监测总站国控重点污染源监督性监测能力建设项目仪器设备采购公开招标公告。　　本次仪器设备采购项目预算金额达2539.3万元，涉VOC监测仪、GC-MS、ICP-MS、XRF、ICP-OES、超高效液相色谱仪等29套环境监测及分析检测设备。　　详情如下：包号采购内容数量预算（万元）简要技术要求1便携式高温红外烟气分析仪1356用于污染源废气中多组分气态污染物的现场直读测试分析，每种污染物至少配置高低2段量程且可自动切换，应采用全程高温采样和红外测试的方法原理。一级标准汞元素发生仪汞溯源系统1用于建立气态汞监测溯源体系，为气态汞监测仪器进行溯源校准；一级标准汞元素发生仪应采用NIST Prime认证源；二级标准汞元素发生仪应采用Vendor Prime认证源。二级标准汞元素发生仪2控制与驱动系统1汞蒸气初级校准源1零空气发生器1低浓度气态汞分析仪（用于汞溯源传递）12便携式傅立叶红外烟气分析仪1380.3用于污染源废气中细颗粒物的稀释通道法采样以及有机/无机多组分气态污染物、非甲烷总烃和颗粒物的现场直读测试，便携式傅立叶红外烟气分析仪应采用全程高温采样和测试分析模式，便携式颗粒物直读测定仪应采用振荡天平称重法测量原理，现场可直接读出烟尘浓度结果。稀释通道采样装置2便携式火焰离子化VOC检测仪2便携式颗粒物直读测定仪13便携式污染源VOC监测仪（GC-MS)1393用于污染源废气中可凝结态颗粒物的现场采样、颗粒物的多级粒径及浓度分布测试、废气VOC有组织和无组织排放的组分定量分析以及固体/液体含汞样品的实验室全自动分析，电称低压冲击器应具备实时的粒径分级分布浓度测量功能，全自动汞分析仪应具备固体、液体样品自动进样器。电称低压冲击器1可凝结态颗粒物采样器1全自动汞分析仪（用于日常汞监测14苏玛罐自动进样-预冷冻浓缩-气相色谱质谱联用仪（包括苏玛罐清洗装置和高精度稀释配气装置，质谱配备FID检测器）1485用于污染源样品中几十种元素、有机污染物、C2~C20之间的极性（醛、醇、酯、酮、醚）和非极性、活性硫、氮化合物等挥发性有机物的定性定量分析，气相色谱-四极杆质谱还可实现自动化固相微萃取衍生、自动化样品液液萃取、自动在线固相萃取等功能。气相色谱-四极杆质谱仪（配CI、EI源及三位一体进样器）1电感耦合等离子体质谱仪15气相色谱-四极杆飞行时间质谱仪1435用于污染源样品中未知污染物的定量、半定量及定性分析。电感耦合等离子体发射光谱仪16十万分之一天平2490用于污染源样品中元素、高沸点有机污染物、有机碳/元素碳的定性和定量分析测试；纯水机1台可制备实验用超纯水，其总有机碳含量(TOC)：≤ 5ppb（μ g/L）；十万分之一天平2台配备滤膜称量组件，同时可检测样品和/或容器上的静电荷，并提供警告和去静电功能。纯水机1反射型多波段有机碳/元素碳分析仪1X射线荧光光谱（XRF）1超高效液相色谱仪（配在线固萃、柱后衍生）1

引言酚类化合物是一种细胞原浆毒，其毒性作用是与细胞原浆中蛋白质发生化学反应，形成变性蛋白质，使细胞失去活性，它所引起的病理变化主要取决于毒物的浓度，低浓度时可使细胞变性，高浓度时使蛋白质凝固，低浓度对局部损害虽不如高浓度严重，但低浓度时由于其渗透力强，可向深部组织渗透，因而后果更加严重。酚类化合物可经皮肤、粘膜的接触，呼吸道吸入和经口进入消化道等多种途径进入体内。 FAO与WHO 早已对2,4-滴、2,4-滴酯类、2,4-滴钠盐、二甲铵盐、2甲4氯、2甲4氯钠、2甲4氯丁酸、2甲4氯丙酸等农药中的游离酚进行了限定，对苯氧羧酸类除草剂中的游离酚进行限量有利于减少有害杂质对农产品安全的影响，也有利于各级质量管理部门对农药产品质量实施监督。进而保证农药产品的安全性、保障人身健康和环境安全。 《GB/T 41225-2021苯氧羧酸类除草剂中游离酚限量及检测方法》新标准已于2022年7月1日正式实施，新标准共给出3种试验方法：化学显色法，高效液相色谱法，液质联用法。 岛津解决方案一、 UV-3600i Plus紫外可见近红外分光光度计高灵敏度—标配三检测器配置了三个检测器，一个检测紫外及可见区域的PMT检测器，检测近红外区域的InGaAs 和 PbS检测器。InGaAs检测器弥补了PMT和 PbS转换波长灵敏度低的特点，从而保证了在整个检测波长范围内高灵敏度测定。在1500 nm波长检测时噪声小于0.00003 Abs，达到超低的噪声水平。 高分辨率—宽测量范围及超低的杂散光采用高性能双光栅单色器，实现高分辨率（分辨率高达0.1nm）和超低杂散光（340nm处杂散光0.00005%以下）。测定波长范围为185nm-3300nm，可在紫外、可见及近红外的宽波段范围进行测定，应对不同领域的测定要求。 丰富可选的附件使用多功能大样品室和积分球附件可测定固体样品，使用保证测定精度的绝对反射测定装置ASR系列也可进行高精度的绝对反射测定。此外，可安装电子冷热式恒温池架和超微量池架等，适应广泛的应用测定。 智能化软件全新升级的LabSolutions UV-Vis软件包括光谱模块，光度模块，动力学及报告编辑模块等功能。软件具有自动光谱评价、自动Excel数据传输、自动样品测试等功能，可升级为DB或者CS版实现更强大的数据管理，确保数据完整性和可信度。 二、Prominence Plus 系列液相色谱仪深根本土，经典焕新。由精心挑选和优化的模块组成稳健的液相色谱系统，Prominence Plus 系列液相色谱仪具有优异的可扩展性和兼容性。无论是常规分析还是高效的快速分析，可让更多的用户得到一如既往的高准确性高可靠性的分析结果，成为各个领域实验室的有力工具，包括制药、生物制药、化学、环境和食品等。 灵动 Prominence Plus系列包含高效/超高效液相色谱系统，灵活兼容常规LC及快速LC分析需求； 经典的积木式设计，基于强大的系统管理器，提供优异的模块扩展性，灵活应对您多样的用需求。 高效 最高支持66Mpa高压输液； 支持2μm-3μm小粒径色谱柱，实现高分离度高灵敏度的快速分析； 可靠 延续Prominence系列一贯的高稳定性、高耐用性、低维护性的特点，助您轻松开展分析工作； 快速液相模式可实现高效而精确的梯度分析，获得理想的保留时间重复性； 专业 60年液相色谱技术沉淀之作，力求优异性能与轻松操作间的平衡； 使用功能强大的LabSolutions工作站，符合GMP法规数据完整性技术要求，匹配实验LIMS系统。 三、超快速液相色谱质谱联用仪岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪 迅捷的速度，敏捷的灵敏度得益于岛津深厚的质谱研发积淀，在诺贝尔获奖者的指导下实现关键技术的突破。作为行业范围内将三重四极杆高灵敏度和高速度相结合的公司，为质谱领域带来真 正意义上的创新。为用户着想，秉承超快速分析的理念，显著提升分析通量，打 造实验室的效率之星。 优异的稳定性，值得信赖的准确性LCMS-8045重视仪器抗污染能力和整体耐用性，即使在严苛的连续分析中也可保 持出色的稳定性，提供准确可靠的分析结果。无论是食品安全还是药物分析，环 境监测还是临床研究，在面对复杂基质样品时都可以轻松应对。 功能丰富的软件，强大的MRM方法包Labsolutions LCMS集合型工作站软件，具备丰富的支持多组分定 量方法制作的便利功能，以直观的界面帮助用户迅速上手。从方 法建立、实时分析到报告编辑，化繁为简，大幅提升分析工作的 效率。更提供多领域分析方法包，无需方法摸索，即刻开展工作。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。