色谱峰面积外标法定量

在实验室埋头苦干多年，也做了无数次定量分析实验，你常用的是内标法还是外标法?您了解两者的区别吗?各自有什么优缺点?　　其实，内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，简单而有效的进行定量分析来满足要求才是最重要的。　　那么，定量分析中怎样选择内标法或外标法?　　一、内标法　　什么叫内标法?怎样选择内标物?　　内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。　　内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。　　采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。　　在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?　　影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。　　由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。　　化学方面的因素包括：　　1、内标物在样品里混合不好 　　2、内标物和样品组分之间发生反应，　　3、内标物纯度可变等。　　对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，　　在制作内标标准曲线时应注意什么?　　在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。　　二、外标法　　什么是外标法？　　用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。　　　　外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：　W=A(W)/(A)　　　　　　　　　　　式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。　　外标法 external standard method 色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。　　外标法误差的来源，除了分离条件的变化之外，就是进样的重复性。使用注射器进样，外标法的误差大约在0.5%以内。但是，使用定量进样阀可获得1%的精密度 若同时小心控制分离参数，分析精密度可达± 0.25%。外标要求仪器重复性很严格，适于大量的分析样品，因为仪器随着使用会有所变化，因此需要定期进行曲线校正。此法的特点是操作简单，计算方便，不需测量校正因子，适于自动分析。但仪器的重现性和操作条件的稳定性必须保证，否则，会影响实验结果。　　三、定量分析中怎样选择内标法或外标法　　选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物(当然是样品中没有的组分)，然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。　　内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。选择内标物有4个要求：　　1.内标物应是该试样中不存在的纯物质 　　2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离 　　3.加入内标物的量应接近于被测组分 　　4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。　　内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。　　内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。　　1、以前做过很多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量分析，没有自动进样器，用外标法定量，确实重现性与稳定性非常差，结果经常受到搞合成同事的质疑。其实，仔细分析原因不一定就是外标法不适合这种定量分析，首先我们的实验室仪器和手段是否调整到一种稳定而合理的状态了，比如，衬管是否洁净，玻璃棉的位置是否合适恰当(能否使样品尽可能的汽化)、汽化温度是否合适、色谱峰形是否对称(也就是样品与色谱柱健合相是否匹配)、附近有没有其它色谱峰的干扰、选用什么进样方式(如快速进样还是热针进样)等等因素的影响都需要考虑，如果这些因素都考虑了，按照GMP方法验证对于精密度的要求，同一样品进6针以上的RSD和配制6个样品的定量结果RSD都能满足小于1.5%的要求，那么这个方法用外标法就是完全适用的，但是前面的影响因素是一定要都考虑到的，否则谈论这个方法是否适用就有失偏颇了。在做过的许多出口产品的定量分析方法当中有许多是一些医药公司提供的比较完善而验证过的方法，内标与外标都有(他们用的都是自动进样)精密度都能满足RSD小于1.5%的要求，当一个方法能够满足测试要求的时候，无论内标外标，都是可行的，当然有一个分析成本和分析时间的问题，内标的成本和控制溶液、样品溶液的配制当然要比外标要高和麻烦一些了。而有些时候，可能受你实验室现有仪器和附属设备的影响，达不到一定的要求，而还必须进行定量分析，有时外标的结果可能就要差一些，这时，你可能就要考虑用内标法了，可以排除手动进样的误差、分流歧视的影响、包括一些未知因素平行误差的影响，这时内标可能就显示出它的优势来了。　　2、上面已经提到当做方法验证的时候，当同一样品配制6个样品溶液用所选用的外标法进行定量的时候，RSD都满足1.5%的要求时，也分为两种情况，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的结果小于1%，那这个方法就没有什么可以怀疑的了 如果RSD的结果大于1%而在1.5%略低一些的范围活动时，这个方法的可行性就将受到质疑，毕竟这是方法验证，你就要考虑上面1所提到的影响因素的影响了，如果排除掉以上的影响因素，RSD还是在1.5%附近，就要尝试内标了，如果内标结果的RSD很好，就证明你的这个方法受实验条件的影响很大，只能用内标了，或者干脆将原方法做大的变动，再尝试用外标法测试。　　3、而对于微量分析，比如农药和兽药残留的分析、环境分析等，根据不同的限量标准要求对于精密度的要求也比常量分析的要求要宽松的多，RSD有时可以允许达到10%甚至更高，这时可能外标法有更大的应用空间。　　4、单从精密度方面去考虑，排除其它成本和效率的因素，个人认为还是内标优于外标。曾经做过一个中间体二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺为内标，RTX-5 amine(碱改性) 15m*0.32mm*1.0um色谱柱分析，将配制好的控制溶液(含有内标物)自动进样器进6针，目的物(二氨基丙醇)与内标物(二乙醇胺)峰面积比率的RSD为0.18%，而只对这六针样品的目的物峰(二氨基丙醇)面积求RSD，结果为0.71%，通过这一实例的结果大家就会发现到底哪个方法精密度更好了，当然是内标更好了。当然这个化合物的检测方法最后根据上面的验证数据用内标和外标定量都是可以的，实验室可以自由选择。但内标与外标精密度结果的差异是显然存在的事实。　　结论：应用外标法能够满足要求，首选还是外标法了，毕竟简单而省事。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下，用内标法还是必要的。无论应用那种方法，方法的验证和确认都是很重要的，只要是按照程序经过验证和确认的方法，都有其应用的空间的。　　另峰面积归一法：如果被分析样品的组分是同系物，校正因子相近可直接用峰面积求出组分的百分含量。如果被分析样品的组分不是同系物，则要知道每种组分的相对校正因子。优点：不必准确知道进样量，操作条件略为变动对结果影响较小，计算方便，适合多组分的工厂例行分析。主要分析对象为任意。　　测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。由于峰面积归一化法误差较大。因此，通常用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另外规定外，不宜用于微量杂质的检查。

以柠檬酸盐缓冲体系的QuEChERS方法为前处理方法，气相色谱-串联质谱联用仪为检测仪器，建立了葡萄中78种农药残留的检测方法。以添加回收法评估了葡萄中4种基质匹配校准方法的定量结果，评估了4种校准方法的线性回归系数，回收率和精密度。结果表明：在添加回收试验中，添加水平为0.01 mg/kg时，4种校准方法在0.005～0.1 mg/L范围内，78种农药的质量浓度与对应的峰面积间线性关系良好，R2均大于0.99，大部分农药的精密度均可满足农药残留检测的要求。然而，在使用空白基质溶液配制的标准工作溶液进行校准时，无论是外标法还是内标法，回收率均无法兼顾所有分析对象。使用基质匹配标准溶液得到的基质标准曲线表现更好，其外标法和内标法的回收率范围分别为82%～114%和81%～110%，相对标准偏差范围分别为2.3%～18%和1.2%～17%，符合食品理化检测的质量控制要求，适合实验室日常监测采用。 气相色谱_串联质谱法测定葡萄中78种农药残留的定量校准方法评估_余巍.pdf

豆芽常检有毒有害成分：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、尿素、恩诺沙星、亚硝酸盐与硝酸盐、亚硫酸盐、赤霉素 据中新网沈阳4月18日报道，沈阳市公安局皇姑分局端掉6个黄豆芽黑加工点，查获掺入非食品添加剂豆芽25余吨，主要送往饭店做水煮鱼和水煮肉片底料。经检测，豆芽中含有亚硝酸钠、尿素、恩诺沙星、6-苄基腺嘌呤激素，其中，人食用含亚硝酸钠的食品会致癌，恩诺沙星是动物专用药，禁止在食品中添加。我司现根据DB33/625.2-2007《无公害豆芽质量安全要求》和《DB11/T 379-2006》豆芽中4-氯本氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2,4-滴、赤霉素、福美双的测定方法汇总出其中所需要色谱耗材供大家参考和选择。 下载pdf： 毒豆芽检测色谱耗材选择指南.pdf粮食和蔬菜中2,4-滴残留量的测定（GB/T 5009.175-2003） 试样中2,4-滴用有机溶剂提取，用三氟化硼丁醇溶液将2,4-滴衍生成2,4-滴丁酯，液液萃取，柱层析净化除去干扰物质，以气相色谱电子捕获检测器测定，依据色谱峰保留时间定性，外标法面积定量。上述带*号产品选择的说明：a.在订购2,4标准品(CDCT-C11940000)后是进行甲酯还是丁酯衍生化？ 国标方法中是采用14%三氟化硼丁醇溶液（CFFC-X0034-1SET）进行丁酯化，北京地方标准方法上采用的是14%三氟化硼甲醇溶液（CFEQ-4-110056-0250）进行甲酯化后检验，从经济的角度和购买的方便性上考虑，我们推荐使用甲酯化的方法，当然，您也可以根据方法需要选择丁酯化方法。b. 是否还需要购买2,4-D甲酯标准品（CDCT-C11945000）或者2,4-D丁酯标准品（CDCT-C11941000）？ 若您选择甲酯化方法，2,4-D经14%三氟化硼甲醇溶液（CFEQ-4-110056-0250）衍生化为2,4-D甲酯，您可选择购买2,4-D甲酯标准品（CDCT-C11945000）； 若你选择丁酯化方法，2,4-D经10-20%三氟化硼丁醇溶液（CFFC-X0034-1SET）衍生为2,4-D丁酯，您可选择购买2,4-D丁酯标准品（CDCT-C11941000）。 选择2,4-D甲酯标准品或者2,4-D丁酯标准品有助于判断2,4-D甲酯或者2,4-D丁酯气相色谱出峰保留时间和计算2,4-D甲酯或者丁酯衍生化过程转化率。 2,4-D甲酯标准品和2,4-D丁酯标准品都是备选产品，可根据您需要选择购买或者不购买。豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的测定(DB11/T 379&mdash 2006) 试样中的4-氯苯氧乙酸钠用稀碱提取后，在酸性条件下用固相萃取柱将样品中的4-氯苯氧乙酸吸附，使其与基体干扰物分离，再用甲醇洗脱并用高效液相色谱法测定，以保留时间定性，外标法峰面积定量。 豆芽中6-苄基腺嘌呤的测定(DB11/T 379&mdash 2006) 豆芽中残留的6-苄基腺嘌呤经酸化甲醇提取后，高效液相色谱法测定，以保留时间定性，外标法峰面积定量。豆芽菜中尿素测定参考《豆芽菜中尿素测定的异常现象分析及方法改进》 正常的绿豆芽在生芽过程中，应不添加任何物质，但其生长过程缓慢、周期长，为加速生长周期，人为的加入尿素促进其生长，使芽变粗变长，但也使豆芽中尿素残留增加，对人体健康构成危害。 检测原理：尿素和亚硝酸钠在酸性溶液中生成二氧化碳和氨的气体，当加入格里斯千试剂时，掺有尿素的样品呈现黄色外观，正常的样品呈现紫红色。注意事项：a.浓硫酸加入量 由于样品的取样量少，少量的浓硫酸即可达到所需的强酸性，因此，建议将浓硫酸的加入量改为0.5ml，为原方法用量的一半；b.亚硝酸钠加入量，当溶液中亚硝酸盐含量高时，与显色剂作用，可呈现黄色，是因为产生的偶氮色素被过量的亚硝酸氧化褪色适当的稀释后方可产生正常紫红色。因为样品中尿素的含量相对较低，它只能与少量的亚硝酸钠作用，当加入过量的亚硝酸钠时，剩余的亚硝酸钠就会将产生的偶氮色素氧化，使之褪色而产生黄色，造成假阳性，故亚硝酸钠的添加量非常关键。当亚硝酸钠的用量减少一半时，但显色效果不明显，当减少到1/4用量时，颜色反应非常灵敏，空白及阴性对照管呈紫红色，阳性管呈黄色，根据尿素的有无样品呈现出不同的颜色。 除产品描述外，上述内容均摘自宋晶瑶、赵玉梅、王琳《豆芽菜中尿素测定的异常现象分析及方法改进》 　 毒豆芽中恩诺沙星检参考:GB/T 21312-2007 动物源性食品中14中喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 方法提要：用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲液（pH4.0）提取样品中的喹诺酮类抗生素，经过滤和离心后，上清液经HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱-质谱/质谱测定，用阴性样品基质加标法定量。 GB 5009.33-2010 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定第一法 离子色谱法 试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。第二法 分光光度法 亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。 GB/T 5009.34-2003食品中亚硫酸盐的测定第一法 盐酸副玫瑰苯胺法 亚硫酸盐与四氯汞钠反应生成稳定的络合物，再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色络合物，与标准系列比较定量。SN 0350-95 出口水果中赤霉素残留量检验方法 以丙酮提取样品中赤霉素，然后用乙酸乙酯提取，再用缓冲溶液凡提取后，在薄层层析板上除去干扰物质，最后用荧光分光光度法测定。了解更多检测方法请进入上海安谱公司网站: www.anpel.com.cn