液相色谱测定虫草素含量

作者：费超;孟蕾;张海鸣;曹杰;刘子沐;杜树山;（中药资源保护与利用北京市重点实验室;北京师范大学校医院;）摘要：目的建立虫草安肺片中盐酸麻黄碱的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法,选用DiamonsilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以乙腈-0.025mol/L磷酸水溶液(5:95)为流动相,流速1.0mL/min,柱温30℃,检测波长为210nm。结果盐酸麻黄碱在1.950～5.850μg范围内呈现良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为99.08%,RSD=3.01%,拖尾因子为1.03。结论本方法快速、简便、准确、重复性较好,结果可靠,可用于控制虫草安肺片制剂的质量。谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208131041_383390_1606903_3.jpg

1 前言 蛹虫草也叫北冬虫草，俗名不老草，是虫，菌结合的药用真菌，现代珍稀中草药。北虫草不仅含有丰富的蛋白质和氨基酸，而且含有30多种人体所需的微量元素，是上等的滋补佳品。蛹虫草中富含虫草素和腺苷，对调节人体内分泌和增强免疫功能等显著作用. 腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷是用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。 虫草素是一种天然来源的药物，具有中医医理中冬虫夏草一样的阴阳同补和双向调节人体平衡的功能；它在护肝、保肾、润肺方面由于成分更纯效果更好，而且大补气血，能消除现在不能治愈的痛经、偏头痛、颈椎增生等疾病。从西医医理角度看虫草素具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。 天然虫草资源已日益匮乏，然而蛹虫草更容易人工栽培 , 因此蛹虫草目前被选为冬虫夏草的最佳替代品 , 已进行了规模化的人工栽培和应用现多用人工虫草来满足市场的需求。注：以上部分内容摘自“百度百科”http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410311605_521149_1669358_3.jpg 本文采用CNW Athena C18-WP色谱柱测定人工蛹虫草中的腺苷和虫草素，并对检测方法进行简单优化，该方法具有简单、快速、重复性好等优点，对人工蛹虫草以及该类保健品的质量控制极为重要。2 实验方法2.1 仪器与试剂Waters e2695液相色谱仪（主要包括2998光电二极管矩阵检测器，柱温箱，自动进样器）；超声波清洗机实验中乙腈为色谱纯；水为超纯水系统制得， 18MΩ•cm，25 ℃虫草素和腺苷标准品，美国Sigma公司2.2 色谱条件色谱柱：CNW Athena C18-WP(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈:水=10:90；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL检测波长：260nm。2.3 样品预处理 称取粉碎均匀的人工蛹虫草样品0.50g于150mL烧杯中，加入约30mL50℃左右的温水，在50℃下超声提取30min，过滤，收集滤液于100mL容量瓶中。用水将滤纸上的样品小心地转移至烧杯中，再重复提取2次，合并提取液，并用水定容至刻度，冷却至室温。吸取少量提取液，用0.45μm滤膜过滤后进样分析。2.4 标准溶液的配制 分别准确称取10.0mg腺苷和虫草素标准品，用水配制成浓度为100μg/mL的标准储备液。临用前，再吸取一定体积的上述标准储备液，配成相应浓度的混合标准溶液。3 结果和讨论3.1 检测波长的确定 利用2998光电二极管矩阵检测器的3D通道扫描的功能，在200~600nm波长范围内对混合标准溶液进行3D光谱扫描。从图中可以看出，腺苷和虫草素在此波长范围内均有吸收，而且都有两个较强的特征吸收波长。在相应的出峰时间提取光谱，从提取的光谱图中可以看到，腺苷的最大吸收波长为205.3nm，次级吸收波长为259.6nm；虫草素的最大吸收波长为206.5nm，次级吸收波长为259.6nm。对比206nm和260nm吸收波长处的色谱图，当检测波长为206nm时，腺苷和虫草素的响应值最大，然而对样品的检测过程中发现，样品中干扰物质在此波长也有很好的吸收，从而影响腺苷和虫草素的定性和定量分析；当检测波长为260nm时，干扰组分少，定性和定量更为准确，综合考虑，选择260nm为腺苷和虫草素的检测波长。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410311609_521156_1669358_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410311610_521157_1669358_3.jpg3.2 流动相条件的优化 流动相中有机相种类和含量对待测组分的分离以及检测时间具有重要的影响。实验中发现，当流动相中乙腈含量为20%时，腺苷和虫草素的出峰时间较早，且未完全分离，不利于样品的检测；当流动相中乙腈含量为10%时，腺苷和虫草素的出峰时间和分离度都比较合适；当流动相中乙腈含量为5%时，虽然腺苷和虫草素也得到了很好的分离，但是大大延长了样品的检测时间，同时响应值也大幅下降，影响待测物质的检出限。结合对样品的检测，最终选择乙腈和水比例为10：90http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410311612_521158_1669358_3.jpg3.3标准曲线的测定 吸取适量体积上述混合标准溶液，用水稀释配成浓度为4.0、[/

[align=center][b][font=宋体]虫草浓缩液中虫草酸和虫草素测定方法[/font][/b][/align][size=18px][font=宋体]虫草浓缩液由虫草水提物制得，用于化妆品原料。客户想测虫草浓缩液中虫草酸和虫草素，虫草酸又名甘露醇。[/font][font='Times New Roman','serif']1 [/font][font=宋体]试剂：乙腈（色谱级），超纯水，甲醇（分析纯），虫草酸和虫草素均购置北京索莱宝公司。[/font][font='Times New Roman','serif']2 [/font][font=宋体]标准品配制：称取一定量的虫草酸，用纯水溶解，定容，得到浓度为[/font][font='Times New Roman','serif']150 μg/mL[/font][font=宋体]，待测；[/font][font=宋体]虫草素，用甲醇溶解，定容，得到浓度为[/font][font='Times New Roman','serif']220 μg/mL[/font][font=宋体]，待测；[/font][font='Times New Roman','serif']3 [/font][font=宋体]样品制备：[/font][font='Times New Roman','serif']3.1 [/font][font=宋体]精密量取[/font][font='Times New Roman','serif']0.5 mL[/font][font=宋体]虫草浓缩液，分别用水定容至[/font][font='Times New Roman','serif']10 mL[/font][font=宋体]测定虫草酸，用甲醇定容至[/font][font='Times New Roman','serif']10 mL[/font][font=宋体]测定虫草素，过[/font][font='Times New Roman','serif']0.45 μm[/font][font=宋体]滤膜，待测。[/font][font='Times New Roman','serif']4 [/font][font=宋体]虫草素[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]条件：[/font][font='Times New Roman','serif']LC-20AT[/font][font=宋体]配制紫外检测器，[/font][font=宋体]波长：[/font][font='Times New Roman','serif']260 nm [/font][font=宋体]；进样量：[/font][font='Times New Roman','serif']5μL[/font][font=宋体]；色谱柱型号：[/font][font='Times New Roman','serif']Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250mm, 5 μm)[/font][font=宋体]；柱温：[/font][font='Times New Roman','serif']30.0 [/font][font=宋体]℃；流速：[/font][font='Times New Roman','serif']0.8 mL/min[/font][font=宋体]；流动相条件如表[/font][font='Times New Roman','serif']1[/font][font=宋体]：[/font][/size][align=center][img=,551,185]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310311641477076_4077_1858223_3.jpg!w551x185.jpg[/img][/align][font='Times New Roman','serif'] [/font][size=18px][font=宋体]虫草酸[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]条件：[/font][font='Times New Roman','serif']Angilent infinit1260[/font][font=宋体]配制示差检测器，进样量：[/font][font='Times New Roman','serif']5[/font][font=宋体]μ[/font][font='Times New Roman','serif']L[/font][font=宋体]；色谱柱型号：[/font][font='Times New Roman','serif']Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm[/font][font=宋体]×[/font][font='Times New Roman','serif']250 mm, 5 μm)[/font][font=宋体]；[/font][font=宋体]柱温：[/font][font='Times New Roman','serif']30.0 [/font][font=宋体]℃，；流动相条件乙腈：纯水[/font][font='Times New Roman','serif']=80:20[/font][font=宋体]；流速：[/font][font='Times New Roman','serif']0.5mL/min[/font][font=宋体]。[/font][/size][align=center][img=,690,265]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310311642440362_8441_1858223_3.jpg!w690x265.jpg[/img][/align][align=center][b][font=宋体]虫草素标准品色谱图[/font][/b][/align][align=center][img=,683,269]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310311642555977_2623_1858223_3.jpg!w683x269.jpg[/img][/align][align=center][b][font=宋体]虫草浓缩液中虫草素色谱图[/font][/b][/align][b][font=宋体]结果：虫草浓缩液中虫草酸含量（[/font]7.65 mg/mL [font=宋体]），虫草素含量（[/font]2.65[/b][font='Times New Roman','serif']μg/mL[/font][b][font=宋体]）。[/font][font=宋体]小结：测定虫草素的过程中发现流动相梯度洗脱，回到起始梯度是需要平衡时间久一些，虫草素含量较低，虫草酸含量比较高。示差检测器也是进样前需要稳定[/font]2[font=宋体]小时左右，才能保证实验数据稳定性。[/font] [/b]