生物发酵过程分析监测系统

生物发酵涉及到医药、轻工、食品、农业、海洋、环保等众多领域，在我国国民经济发展中占有极其重要地位，是当前经济社会发展急需突破的技术领域，也是当前世界各国发展的热点领域。在生物发酵过程中，对发酵尾气中各种气体组分的检测有着相当重要的地位。发酵尾气的组分变化，反映了整个发酵过程中物质的变化情况，对尾气数据的分析，可对发酵过程起到监测的作用。 在项目完成过程中，项目组根据发酵尾气的特点以及现场应用环境的要求，对尾气预处理、采集、分析、数据处理等进行了一系列的条件优化，最终建立了一套“在线质谱仪直接分析生物发酵尾气的方法”和标准操作程序。采用SHP8400PMS在线质谱仪可对发酵尾气进行直接分析，实现实时自动在线监测，能够获得连续稳定的准确测量结果，对氧气、二氧化碳、氮气、氩气以及各种挥发性的物质进行高精度定量分析，提高了监测效率。目前该方法已成功应用于国家生化工程技术研究中心(上海)的发酵工程研究和多家生物制药企业的生产现场监测，具有推广应用的示范意义，为建立行业标准方法打下基础。专家组在给予项目肯定和高度评价的同时，也提出了相当中肯的进一步研究建议，希望能将国产质谱仪更好的应用于现场监测领域。

发酵过程中，细胞浓度是一个非常重要的生理参数，不但可以计算比生长速率，底物消耗速率、生物量产率和维持系数等参数，还可以及时判断是否有染菌等异常情况发生。目前测量细胞浓度的方法主要有化学法（DNA/RNA分析）和物理法（干重、光密度、呼吸商等）两大类。一般来说，与物理法相比，化学法能较准确的测量有代谢活性的生物量，缺点是花费时间长，而利用物理法测量，无法区分区分处于悬浮状态的颗粒和微生物，也无法分别活死细胞。 实现在线活细胞浓度一直是发酵领域的热门话题，仅些年来出现了不少的测量方法，依据的工作原理也是五花八门，其中最具代表性的有声学，激光散色、荧光、核磁、量热或电容。 其中法国fogale公司的测量仪器，以电容法为工作原理，直接将传感器安装与发酵罐上，可承受121℃高温灭菌，理论技术也比较成熟，是目前最为理想的适合工业级别的在线活细胞传感器。工作原理：电容传感器采用活细胞的介电特性，实时连续测量活细胞的生物体积，可应用于实验室桌面型的反应器或者是工业规模的大型反应器两对对电极位于传感器的顶部，一对用于在培养基中产生交变的电场，在电场范围内，带有完整细胞膜的细胞会在培养基中发生极化现象，发生极化的细胞可以认为是极小的电容，死细胞或者其他粒子没有完整的细胞膜，所以不能形成电容型号。另一对电极用于检测培养基中的介电信号，培养基中的介电信号和细胞的浓度是精确关联的。细胞的极化率和电场的频率纯在函数关系，当频率增加时，培养基中细胞的介电常数由低频峰（最大极化）降低到高频峰（最小极化）。这种随频率增加极化率降低的现象称为β-散射。传感器采用双频测量模式：培养基的基线在10MHz左右得到，细胞的信号在临界频率区域获得，在曲线的拐点，（动物细胞和细菌在1MHz，酵母在2MHz）我们获得了最佳的信号线性。应用：这项技术可广泛应用于各种细胞培养，生物发酵过程。已被文献证实可应用的细胞如下：动物细胞：CHO, BHK, MDCK, PERC6, NSO, HEK, Hela,Hybridoma, Vero细 菌：E.Coli, Bacillus Thuringensis, Salmonella,Streptomyces, Lactic Bacteria酵 母：Pichia Pastoris, Saccharomyces Cervisiae, PolymorphaHasenula昆虫细胞：sf9, Hi-5真 菌：Absidia

传统的酿造工业和近代发酵工业多为劳动密集型产业，自动化程度较低。近些年来随着连续发酵技术、现代生物分离技术、生物反应器技术、生物传感器技术等现代生物工程技术快速发展．基因工程生物新产品不断出现，加快了发酵工业向技术密集型转变的进程。而影响这一进程的关键因素之一就是发酵过程最优化控制技术，特别是发酵过程连续在线监测控制技术。发酵过程是一个非性线、多变量和随机性的动态过程，发酵体系是一个复杂的被控对象。温度、溶氧、pH、培养基成分、细胞形态、细胞浓度、产物组成及含量等均是发酵过程的重要控制参数。以往测定这些参数采用离线分析，不能及时反映发酵过程的状态，无法实现自动控制和连续跟踪。因此，工业发酵过程中最优化控制技术主要是在线测控系统。在线测控系统可连续、迅速、准确实现取样、检测、信号处理、反馈控制等过程，实现工业发酵过程最优化的自动控制。随着计算机及控制技术的突飞猛进，生物传感器技术的发展，发酵动力学模型研究的完善，发酵过程控制系统愈来愈多，应用范围亦越来越广。但是，工业上实现发酵过程最优化自动控制的实例却不多，仍以人工控制和半自动控制为主。1 工业发酵过程最优化控制的现状与难点总的来看，目前发酵工厂发酵过程的计算机应用和自动化控制程度不高，落后于其他领域。现代化的发酵工厂已初步实现对部分因素如温度、溶氧、pH、搅拌转速、流速等的在线检测，也可对其变化进行单因素控制，但仍与发酵最优化的自动控制目标相去甚远，即难以成功建立对培养系统进行系统的反馈性控制。其发展滞后的主要原因如下：1．1 微生物生长代谢的特殊性 这是由于发酵过程的微生物学属性，使得其不同于一般的化学反应系统，其特殊性表现在：1)微生物细胞的生长繁殖、产物的代谢既随外界条件的变化而变化，亦随遗传基因的变异而变化；2)微生物细胞是有生命的，必然要经历幼龄、壮龄、衰老和死亡等过程，发酵过程微生物之间是不同步的，微生物个体之间是有差异的；3)相当一部分发酵过程的生物化学反应途径尚不清楚，难以对反应变化进行精确的计算。因此，目前的发酵动力学模型多为经验或半经验模型，或为简化的模型；4)人类对生命科学的认知程度很低，即使对最简单的生物一微生物的认知程度也不充分，对发酵机理的认识还远远不够，对许多发酵产物形成的代谢调控机制还没有完全研究清楚，难以确立最佳的控制条件和手段；5)细胞的生长和目的代谢产物的形成最优控制条件往往是不一致的。1．2 发酵生产过程控制的复杂性 影响发酵生产过程的因素较多，远比一般化工生产过程复杂，对生产过程控制的难度较大，具体体现在以下几个方面：1)发酵过程是生化反应与化学物质跨膜(细胞膜)传输过程的叠加，属于气、液、固三相反应系统；2)由于菌体(尤其是菌丝体)的数量变化和各种代谢产物的不断积累，发酵过程发酵液粘度变化复杂，多呈非牛顿型流体性质，给传质、传热的控制带来困难；3)影响生化反应的因素除物理因素和化学因素外，还有生物因素，如细胞之间的影响、杂菌的干扰等；且这些因素又互相关联，给反应过程控制带来困难。无菌操作对生产设备和工艺都有特殊的要求；4)发酵原料多属生物材料，一般使用天然或半天然培养基，培养基成分复杂。因此，实际生产中只能对主要成分进行检控；5)生物反应器不同于一般的化学反应器，要人工提供微生物生长代谢的最佳物理、化学和生态的环境。要在生物反应器内保持菌种的最佳状态，减少各种营养物、代谢物对细胞生长和代谢的阻遏效应等均较困难；6)供在线检测用的传感器的种类和质量还远不能满足发酵最优化控制的要求。2 工业发酵过程最优化控制对策目前的最优化控制条件大多建立在经验的基础上，要取得发酵过程最优控制的突破，首先需要具体发酵产品的微生物生长代谢，发酵调控原理认识的突破，并在此基础上运用科学的方法建立发酵过程数学模型，为计算机的应用提供条件。其次，建立和完善硬件技术，即发酵过程各种参数在线检测控制的设备技术。2．1 发展完善发酵过程在线测控技术 发酵过程在线测控装置一般包括三个部分：分析检测装置(传感器)、将检测装置与发酵介质相结合的取样过滤装置、实现控制理论的反馈和控制装置，即信号传输装置和计算机。目前正在应用和研究的在线测控装置有以下几种。2．1．1传感器系统 一种直插式传感器，为直接安装在反应器内实现在线监控的传感器。已用于发酵生产中的主要是罐内物化参数的测定，如温度、溶氧、pH、转速、罐压、粘度、浊度及流量等。此类传感器的性能较稳定，应用也较为普遍，在氨基酸发酵、啤酒发酵等生产中均有应用，实现了部分参数的在线监控。其主要特点是能够承受高温高压环境，常用的有热电偶传感器、转速传感器、测力传感器、玻璃传感器、光学传感器及溶氧传感器等。另外，微生物传感器可用于测量发酵工业中的原材料（如糖蜜、乙酸等）和代谢产物（如谷氨酸、乳酸等）测量装置基本上都是由适合的微生物电极与氧电极组成原理是利用微生物的同化作用耗氧通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量从而达到测量底物浓度的目的。在测定微生物细胞数量时，在阳极Pt表面上菌体可以直接被氧化并产生电流，这种电化学系统可以应用于细胞数目的测定。测定结果与常规的细胞计数法测定的数值相近，利用这种电化学微生物细胞数传感器可以实现菌体浓度连续、在线测定。2．1．2 流动注射检测系统(FIA) 有些传感器不能承受高温高压环境或不适合微生物发酵环境，因此不能作为直插式传感器直接在发酵罐内使用，如生物传感器。流动注射检测系统(FIA)可较好地解决这一问题，FIA 系统由取样装置、样品预处理装置、泵、注射选择阀、传感器、信号转移和数据处理计算机等组成。生物传感器安装于反应器外，样品被处理后送至反应器外与生物传感器接触反应产生信号，实现发酵过程的在线测控。常用于FIA系统的生物传感器有电流式电极、pH 电极、Bio—FEF电极、光学生物传感器、光纤生物传感器以及化学发光传感器等。2．1．3 映象在线控制系统 随着光学技术的不断发展，直接将光学显微镜安装在反应器内，在线监测发酵过程中细胞的形态和生理状态，并可以对细胞数量、大小、种类进行计算统计，荧光显微镜还可以监测细胞代谢过程。将映象在线控制系统与流动注射检测系统结合，可成为更有效的监测系统。一个典型例子是用于在线监测细胞培养状态的FI—FCM系统。该系统样品首先从生物反应器传人多位置的真空管并同时排空，数十种不同的样品和反应剂被筛选，通过连接着十条真空管的精密注射泵导人系统，连接着双向真空管的微室用于稀释样品或将样品与不同的反应剂混合。然后将处理后的样品通过自由脉冲方式注人流动细胞测定仪，流动细胞测定仪可测定培养过程中细胞大小和数量、通过观察荧光变化检测绿色荧光蛋白形成的动力学过程等，流动细胞测定仪的数据处理由主机完成，连接有系统控制板和数据控制板的计算机对系统进行控制。