质谱检测蛋白磷酸化位点方法

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  • 南宁市蓝光生物技术有限公司成立于2008年,坐落在广西南宁市高新技术开发区。是一家由活跃在美国、加拿大生物科技前沿的华人科学家和留学生创建的。其核心技术及研发平台由加拿大ICP免疫公司和美国、加拿大数家拥有一流科学家和设备的实验室提供。蓝光生物的产品和服务包括多肽合成、抗体制备、基因克隆和蛋白表达、免疫学和细胞生物学相关试剂以及技术支持等。目前,公司已开发出近百种用于基础生物医学研究的各种抗体、各种广泛应用于诊断的标记第二抗体、5种固相非放射性同位素蛋白激酶活性测试盒【PKC,PKA,AKT,SGK和S6K蛋白激酶测试盒】、及用于蛋白组学和药物筛选的甲基化、乙酰化、磷酸化等翻译后修饰蛋白质组学的抗体和填料。这些产品可应用于染色体修饰、细胞周期、细胞周期检验点、细胞凋亡、核因子、神经因子、细胞因子、酪氨酸激酶、翻译调控因子、淋巴细胞信号传导因子、糖代谢等细胞信号传导通路的科学研究。其中,用于药物筛选和基础科研的非放射性同位素蛋白激酶活性测试盒属世界首创;自主研发的甲基化、乙酰化、磷酸化特异性抗体及亲和色谱填料等翻译后修饰蛋白质组学抗体和填料等系列产品畅销国内外。客户用我们的产品进行科学研究,论文发表在SCIENCE、NATURE、CELL等高质量的学术杂志上。
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  • 北京百泰派克生物科技有限公司(Beijing Biotech Pack Scientific Co., Ltd. 简称BTP)成立于2015年,是国家级高新技术企业,业务范围主要围绕蛋白和小分子代谢物检测两大板块,从事蛋白质和小分子代谢物的理化性质分析及结构解析等相关技术服务,为客户提供高性价比、高效率的技术服务。深耕蛋白鉴定、定量蛋白组(iTRAQ/TMT、label free、DIA/SWATCH)、PRM靶蛋白定量、蛋白和抗体测序、蛋白修饰(二硫键、糖基化、磷酸化、乙酰化、泛素化等)、靶向和非靶向代谢物检测。百泰派克生物科技检测平台包括:检测分析平台、蛋白质组学分析平台、代谢组学分析平台、蛋白质从头测序平台、生物制药分析平台和流式细胞多因子检测平台。公司拥有独立的质谱实验室、色谱实验室、细胞培养室和免疫学实验室,以及高分辨率质谱仪和高效液相色谱。目前已与国内外多家药物研发企业,以及哈佛大学、北京大学在内的国内外高校建立了合作关系,协助客户发表了多篇中英文文章,包括Cell等多家高水平期刊。公司自主检测平台发展至今,已覆盖蛋白质组学、代谢组学、生物制药、生信分析等多组学检测平台,积累了丰富的实践经验,凭借专业的技术和优质的服务水平,客户覆盖北京大学、清华大学、中科院等多所知名院校,也与国内外多家药物研发企业建立合作关系。公司始终致力于为各科研院校、企业和机构提供高效、准确、高性价比的蛋白质(组)研究技术包裹,助力客户在基础研究、分子诊断及其他生命科学研究领域取得突破,为生命科学的发展做出贡献。百泰派克技术平台检测分析平台:多台高分辨率质谱仪、高效液相色谱、气相色谱,NMR。蛋白质组分析平台:Label-free、iTRAQ、SILAC、SWATH、MRM;蛋白质定性定量鉴定、蛋白质差异分析、发现疾病标记物、发现药物靶标。代谢组分析平台:靶向代谢组学、非靶向代谢组学、脂质组学分析;通量达1000种代谢分子、代谢通路分析、代谢靶标鉴定。流式细胞多因子检测平台:CBA、FlowCytomix;微量样品需求,分析多种细胞因子。 蛋白质从头测序平台:Obitrap Fusion Lumos质谱仪、PEAKS软件分析;100%序列测定,精准蛋白、抗体测序。生物制药分析平台:生物药物鉴定、变异性分析、纯度分析。流式细胞多因子检测平台:CBA、FlowCytomix;微量样品需求,分析多种细胞因子。
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  • 400-860-5168转4294
    英芮诚生化科技(Enriching Biotechnology)成立于2013年,是目前高端生物纳米磁珠领域产品种类最丰富、产能最大、集产学研于一体的国家级高新技术企业。英芮诚生化科技坚守为伙伴创造价值的理念,依托复旦大学国际领先的生物纳米材料开发技术,由多位教授、博士和硕士组成强大的研发团队,在纳米微米磁珠粒径精确控制及放大生产方面、表面官能团化修饰方面有着丰富的经验。英芮诚所有生物纳米磁珠产品均具有独立知识产权,以当前本领域国际最领先的生物纳米磁珠产品为研发参照和自控标准,并不断做新的突破,使得“英芮诚”成为体外诊断、高通量筛选、磁性生物分离、细胞标记以及新型诊断和治疗的研究与开发的可靠合作伙伴。英芮诚先后研发完毕200余款应用于不同领域的生物纳米磁珠,率先实现了多款代表国际顶级技术水平的多款生物纳米磁珠及高通量、自动化仪器的问世,填补多项国内空白,并次第实现产业化。一系列精妙绝伦的高端生物纳米磁珠问世,标志着“英芮诚”正以精湛的技术正逐步成为国内生物纳米磁珠领域的领军品牌,以优异的技术水平逐步走向生物纳米磁珠领域的国际前沿。英芮诚生化科技系列生物纳米磁珠产品粒径涵盖20nm-50μm,产品与服务主要涵盖四个方面:【高端生物纳米磁珠】* 磁微粒化学发光用免疫诊断磁珠* 系列标签蛋白纯化磁珠* 磷酸化修饰蛋白纯化磁珠* 免疫沉淀、免疫共沉淀用蛋白质相互作用磁珠* 细胞分选磁珠* 系列链霉亲和素磁珠(SA磁珠)* 系列核酸纯化磁珠* 功能修饰磁珠:NHS、羧基、氨基、环氧基、甲苯磺酰基(Tosyl)等【全自动高通量核酸提取仪 及 磁珠法核酸提取试剂盒】* 32位、192位全自动核酸提取仪* 24位cfDNA用大体积核酸提取仪* 24位磁珠法QuEChERS专用农残提取仪* 8*96孔板用超高通量振荡器* 承接各种磁珠法高通量提取仪器的开发* 唾液、血液、拭子、血斑、动植物组织等40余款磁珠法核酸提取试剂盒【外包服务】* 核酸提取外包服务* 蛋白偶联外包服务 * 个性化磁珠订制外包服务【客制化解决方案】* 客制化生物纳米磁珠* 客制化高通量智能仪器 * 客制化生物有机物捕获方案公司获得了多项荣誉:第二届中国创新创业大赛(上海赛区)优胜奖江苏省民营科技企业上海杨浦“延吉杯”十大创业之星江苏省科技型中小企业上海杨浦鼎元资金科技创业人才江苏省六大人才高峰项目常熟市海内外创新创业领军人才江苏省高层次双创人才姑苏科技创业天使计划人才常熟2016年度优秀创新创业企业苏州市姑苏创新创业领军人才国家级高新技术企业
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质谱检测蛋白磷酸化位点方法相关的仪器

  • timsTOF Pro 2由平行累积连续碎裂技术( PASEF )驱动,使得 4D-蛋白质组学和 4D-脂质组学为无偏向性细胞和血浆蛋白质组学、液体活检多组生物标志物发现,以及整合基因组学、蛋白质组学和表观蛋白质组学拓宽了道路。4D-组学时代 —— 解锁第四维度的价值4D-组学的重大突破速度:PASEF 技术实现了在不影响分辨率情况下达到超过 120 Hz 扫描速度。深度:额外一维离子淌度提高了数据完整性。高通量:超快数据采集速度使其可以使用短梯度实现生物样本的高通量分析。耐用性:独特的仪器设计使得其可以连续分析数千个样品,仪器保持稳定的性能而无需清洁。4D-Proteomics&trade 的新标准:更快速度实现蛋白质组全覆盖基于质谱( MS )的蛋白质组学一次可实现样本里成千上万蛋白的定性和定量。然而,受到目前质谱仪的扫描速度、灵敏度和分辨率的影响,实现蛋白质组的全覆盖仍然具有挑战性。timsTOF Pro 2 使用平行累积连续碎列( PASEF )的技术可实现极高的扫描速度和灵敏度,只需要少量样本就可以达到蛋白质组学鉴定新深度。双 TIMS 和 CCS 的分析捕集离子淌度谱( TIMS )首先是一项重要的气相分离技术,它是在高效液相色谱( HPLC )和质谱分离的基础上,带来额外一个维度的分离,可大大降低样品分析复杂度,极大提高峰容量和分析物鉴定可靠性。同样重要的是,TIMS 离子淌度管能对离子实现时间和空间上的聚焦,从而独特地提高灵敏度和扫描速度。双 TIMS 技术可以实现近乎 100% 的离子利用率,离子在前一根淌度管内累积,在后一根淌度管内根据离子淌度值分批释放。这种平行累积连续碎裂( PASEF )的过程能够实现碰撞横截面( CCS )的分析。CCS 额外一个维度信息能够提供很多进一步的分析可能性,可以从复杂数据库实现化合物的高可信度库匹配以及更低的错误发现率( FDRs )。4D-Proteomics&trade 的新标准:更快速度实现蛋白质组全覆盖基于质谱( MS )的蛋白质组学一次可实现样本里成千上万蛋白的定性和定量。然而,受到目前质谱仪的扫描速度、灵敏度和分辨率的影响,实现蛋白质组的全覆盖仍然具有挑战性。timsTOF Pro 2 使用平行累积连续碎列( PASEF )的技术可实现极高的扫描速度和灵敏度,只需要少量样本就可以达到蛋白质组学鉴定新深度。双 TIMS 和 CCS 的分析捕集离子淌度谱( TIMS )首先是一项重要的气相分离技术,它是在高效液相色谱( HPLC )和质谱分离的基础上,带来额外一个维度的分离,可大大降低样品分析复杂度,极大提高峰容量和分析物鉴定可靠性。同样重要的是,TIMS 离子淌度管能对离子实现时间和空间上的聚焦,从而独特地提高灵敏度和扫描速度。双 TIMS 技术可以实现近乎 100% 的离子利用率,离子在前一根淌度管内累积,在后一根淌度管内根据离子淌度值分批释放。这种平行累积连续碎裂( PASEF )的过程能够实现碰撞横截面( CCS )的分析。CCS 额外一个维度信息能够提供很多进一步的分析可能性,可以从复杂数据库实现化合物的高可信度库匹配以及更低的错误发现率( FDRs )。极高的稳定性和通量无需清洗许多用于蛋白质组学应用的 MS 仪器需要每月清洁一次,在大样本组中每天 24 小时运行。仪器性能下降即使在较短的时间段内也是显而易见的。timsTOF Pro 2 卓越稳定性意味着仪器可以全天运行很多周,而没有明显的信号和其它性能下降。PaSER Run & Done —— 加快4D-蛋白质组学的鉴定速度PaSER( 实时平行搜索引擎 )是一个结合硬件和软件的解决方案,能够实现基于样本序列管理的实时数据库搜索引擎。PaSER 以很快的速度就能提供结果,包括 PTM 搜索。通过使用基于 GPU 的搜索,PaSER 在实时或离线模式下可以提供相同的结果,而无需使用简化的算法或中间步骤。PaSER 极快的搜索速度使得在数据采集结束后数秒就能同步拿到搜库结果,真正实现运行并完成! PaSER 有效地打破了大队列样本数据分析通量壁垒。此外,实时蛋白组学的非标记定量也可以跨越 PaSER 获得的数据结果集,使其瞬间能过渡到定量蛋白质组学。通过 TIMS Viz 使得淌度偏移质量对齐( MOMA )变得可视化 ,从而用户可以鉴定和识别只有 4D-Omics 才能看到的共洗脱多肽。 dia-PASEF 增加鉴定可信度dia-PASEF比传统的 DIA 方法有更高灵敏度和选择性,是因为它将 PASEF 原理也应用进来,结合了 DIA 的优点和 PASEF 离子利用率高的优势。TIMS 分离提高了选择性,而且可以将单电荷母离子排除掉,从而降低本底噪音干扰。利用分子量和碰撞横截面 CCS 值的相关性,dia-PASEF 能够实现高可信度化合物鉴定。在 LC-MS/MS分析中, dia-PASEF 能够采集包含 m/z,离子淌度值( CCS ),保留时间和离子强度的 4D 数据。前所未有的蛋白质覆盖深度凭借强大的 SRIG( 不锈钢堆叠环形离子向导 )装置和新优化的 dda-PASEF 方法 ,timsTOF Pro 2 单针能够达到前所未有的蛋白组学覆盖深度。使用自制 HEK 酶切样本, 上样 200 ng,使用 Aurora - 25cm 色谱柱,在 60 分钟梯度下能够鉴定 超过 7,000个 蛋白和 60,000 条多肽。因此 timsTOF Pro 2 可以通过数据库搜索和运行之间的匹配,无需任何谱图库,在一些日常细胞系蛋白组定量实验中实现很高的蛋白覆盖深度。超高灵敏度的高通量靶向蛋白质组学和常规的靶向蛋白组学分析技术( SRM 和 PRM )相比,prm-PASEF 在单针中可极大提高监测多肽数目,同时不影响仪器选择性或灵敏度。靶向质谱( MS )技术是蛋白质组学实验中一种强大的技术,用来验证大队列样本中的候选生物标志物。与数据依赖采集( DDA )和数据非依赖采集( DIA )相比,这可以增加检测灵敏度。可是该技术受到在单针中监测离子数目和液相分离出峰时长以及整体灵敏度间的折中限制。只有通过更长的色谱分离时长或降低质谱的灵敏度和选择性,才能获得大量目标肽的完整数据。prm-PASEF 可以极大地提高单针中靶向监测的多肽数目,这得益于布鲁克 timsTOF Pro 2 的第四维分离可以极大提高选择性和灵敏度, PASEF 技术带来的速度可以增加靶向分析离子数量。超高灵敏度应对最困难的分析挑战随着某些特定细胞、少量细胞群或生物穿刺样本的生物研究越来越重要,低样本量蛋白组定量变得至关重要。而如此低的样本量对于质谱灵敏度提出了很高要求。使用高灵敏度的质谱仪对如此低的样本量进行原型定量至关重要。timsTOF Pro 2 上样 200 ng HeLa 样本,使用 Aurora - 25cm 色谱柱,在 30 分钟梯度下使用 PaSER 能够鉴定超过 74,200 个蛋白和接近 30,000 条多肽。dia-PASEF —— 高通量定量蛋白质组学中实现无与伦比的数据完整性和分析深度使用标准 dia-PASEF 方法多针测试结果有着很高重复性。三种不同的 dia-PASEF 窗口设置下使用 Aurora-25cm 柱在 60 分钟梯度下可实现接近 8,000 个蛋白定量和超过 70,000 条多肽,而且有极高的定量准确性。高灵敏度磷酸化蛋白组学分析和同分异构体分离支持 CCS 的近邻位磷酸化位点定量dia-PASEF 在 timsTOF Pro 2 上的高灵敏度、扫描速度和重现性甚至可以实现低样本量的磷酸化蛋白质组学分析。例如可以实现小鼠脑样本起始总蛋白仅为 25 μg 的磷酸化蛋白质组的非标记定量。使用 Evosep 每天 30 个样本的分析方法,三次重复可鉴定出多达 4,473 个 unique 磷酸化多肽。这些结果为针刺活检的应用带来了希望,可以用信号转导的信息补充癌症蛋白质基因组学数据。这些结果为针刺活检的应用带来了希望。此研究结果由 Stefan Tenzer 教授提供。分析样本量有限时的细胞信号传导当肽段在色谱上发生共洗脱时,由于等重性和信号重合,不能测量 CCS 值的传统蛋白质组学是不能实现磷酸化肽异构体的定量的。PASEF 技术使得基于 TiO2 富集时,使用 150 ug 蛋白富集起始量就能够鉴定 27,768 个磷酸化肽,展现了淌度偏离质量对齐( MOMA )的优点。1,946 条鉴定的共洗脱异构体中,20% 的异构体可以被TIMS 完全分离,这可以使得我们可以更好地理解邻位蛋白磷酸化位点信息。
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  • Thermo Scientific LTQ XL质谱与Ultimate 3000高速液相色谱系统联用,是高通量分析的最佳工具。结合多种解离技术,包括脉冲碰撞解离(PQD)和电子转移解离(ETD),LTQ XL提供最丰富的结构信息。广泛应用于蛋白质组学、代谢物鉴定、药物研发定量分析、法医和临床分析等领域。LTQ XL功能简介:1.可升级的电子转移裂解(ETD)模块可以提供传统裂解方法无法得到的蛋白质翻译后修饰信息;2.脉冲碰撞能量诱导解离(PQD)功能可以提供低质量端碎片离子信息;3.高选择MS/MS分析给谱图在数据库和谱库检索更好的匹配,提高了结构确证的可靠性。另外快速极性切换,母离子相关MS3数据关联扫描,可以对翻译后修饰和代谢物组成的鉴定进行智能、快速分析,还可以和高端的回旋共振质谱组合成最先进的多级高分辨杂交质谱仪;4.自动数据依赖性多级质谱采集技术不仅为用户提供预测代谢物(母离子列表)结构信息,也能提供未预测到的代谢物结构信息。此外使用自动固定中性丢失数据依赖性(CNL)扫描触发三级质谱扫描能检测某一类的代谢物。使用MetworksTM 和Mass Frontier分析软件增强复杂基质中代谢物筛选和鉴别功能,使谱图解析更简便。离子化技术:* IonMax离子源:ESI(电喷雾电离),APCI(大气压化学电离)和APPI(大气压光电离)探头都是基于革新的Ion Max离子源而设计。它具有超高性能,结构简单以及无需工具就可进行ESI和APCI探头更换的特点,探头在x,y,z三个方向均可调节。无论对于低流速还是高流速,都可以优化最佳位置获得最好的灵敏度。* 满足各种需要的离子源配置:ESI(电喷雾电离源),APCI(大气压化学电离源),APPI(大气压光电离源),纳喷电离源(NSI)。主要应用:* 应对代谢物鉴定和确证,LTQ系列质谱可自动查找到所有可能的代谢物。* 基于离子/离子化学的电子转移解离(ETD),LTQ XL离子阱是实现此技术的最完美仪器。ETD与CID互为补充,提高蛋白序列覆盖率;保护不稳定PTM翻译后修饰基团,简化数据分析;单次进样自动启动CID和ETD。* 母离子智能选择:自动数据依赖多级质谱采集技术不仅能为用户提供预测代谢物(母离子列表)结构信息,也能提供提供未预测的代谢物结构信息。此外,使用自动固定中性丢失数据依赖性(CNL)扫描触发三级质谱扫描能检测某一类的代谢物。使用MetWorks和MassFrontier分析软件增强复杂基质钟代谢物筛选和鉴别功能,使谱图解析更加简便。* 应对蛋白质组学和生物标记问题,ETD解离技术使LTQ XL成为蛋白质组学研究更强大的分析工具。* LTQ和LTQ XL质谱均可配置ETD裂解源,ETD能够为线性离子阱提供类似ECD(电子捕获解离)的裂解碎片,在生成大量肽段碎片的同时,保护不稳定的PTM翻译后修饰集团,例如磷酸化翻译后修饰。ETD功能与赛默飞世尔线性离子阱的高离子储存量相结合,是蛋白质和肽类分析的新型有效工具。
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  • Thermo ScientificTM LTQ Orbitrap XLTM应用LTQ Orbitrap技术,为各种实验室提供突破性技术服务。通过强大的功能,稳定性以及低运行成本成为蛋白质组学和代谢组学应用的最佳选择,完全超过并替代 Q-TOF系统。通过高分辨以及精确的质量分析能力,使组合式质谱系统实现差异表达的高通量无标记鉴定。LTQ Orbitrap XL其无与伦比的MS和MSn灵敏度、快速扫描速率、高质量精确度,高分辨能力,无疑是蛋白质鉴定和生物标记领域的理想选择。基于非常成功LTQ Orbitrap平台,该仪器实现更强的操作性和灵活性。LTQ Orbitrap XL采用全新HCD八极碰撞反应池,实现更灵活的MS/MS应用,包括肽段定量分析iTRAQTM,PTM分析,de novo 序列分析以及代谢组学研究。这一蛋白质分析平台还可以升级联用ETD(电子转移裂解源)来控制肽段和蛋白质解离,成为蛋白质组学研究中不可获缺的分析仪器。同时,MSn能力使其成为小分子确认和鉴定的最有力工具。LTQ Orbitrap XL具有高灵敏度,能够达到30K分辨率,同时,超强的扫描速率实现痕量级和同质量分析物的分离。 赛默飞专利的ETD技术为LTQ Orbitrap XL增加了高灵敏度翻译后修饰分析能力. ETD与LTQ Orbitrap XL联用组成了最先进的蛋白质组学平台, 可以提供三个互补性解离技术,用于确定性蛋白/多肽表征, 翻译后修饰(PTM)分析 (尤其是磷酸化),及Top-down或Middle-down的蛋白和多肽序列分析。 全新的MALDI源,将可被安装于LTQ Orbitrap XL和Discovery,是蛋白质组学和代谢组学应用的理想选择。利用LTQ Orbitrap的高分辨能力和质量精度, 研究者可以进行MALDI离子源的多肽和蛋白鉴定,还有包括双向电泳中2D胶点酶解、从头测序、TMT定量、组织成像和小分子分析等等其他重要用途。
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质谱检测蛋白磷酸化位点方法相关的资讯

  • 磷酸化蛋白,液体活检全新维度——访北美华人质谱学会主席陶纬国教授
    p    span style=" font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai " 回顾2017年,基于质谱的临床研究有一项突破性发现。普渡大学陶纬国教授团队在2017年3月20日的《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志上发表文章称,他们从人体血液中发现2400多种磷酸化蛋白。该发现首次证明了磷酸化蛋白可以作为基于液体活检的疾病标志物,能用于对癌症等重大疾病更早、更精准的非侵入性诊断,为 “液体活检”提供了全新的检测维度。近日,仪器信息网专访了陶纬国。 /span /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/a21a903c-0479-4776-9e2a-5b5c719f76fc.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 普渡大学 陶纬国教授 /strong /p p    span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 磷酸化蛋白突破性发现 /strong /span /p p   通过液体活检来诊断肿瘤和癌症等疾病一直是临床科学家关注的焦点,研究对象多集中在循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA),但是二者都有局限性:由于CTC在血清中的浓度非常低,取少量血液对其检测难度很大 癌症有很多基因突变,而这些突变不一定会显现出来,因此基于ctDNA进行的液体活检的诊断结果只能预测患病的概率,并不能确诊。 /p p   蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本,最普遍,也是最重要的机制,同时,与许多疾病的发生密切相关。在众多肿瘤致病机理中,当前学术界对蛋白质磷酸化机理的研究最为清楚,80%-90%的癌症都跟蛋白质磷酸化有关。因此,许多抗肿瘤药物的研制都着眼于磷酸化蛋白。理论上,磷酸化蛋白作为相关基因突变的表达,在临床上能够帮助医生做出更明确的诊断。但是,有关基于液体活检的磷酸化蛋白研究还很少。此前,有个别报道在血液中发现几十种磷酸化蛋白,均是高丰度蛋白,生物学意义不大。“原因就是磷酸化蛋白一旦从细胞进入血液中就被肝脏分泌的磷酸酶水解了。”陶纬国解释说,“所以虽然磷酸化蛋白跟癌症关系非常密切,但人们无法对其进行检测。” /p p   陶纬国团队是如何从人体血液中检测到大量磷酸化蛋白的呢?这要从三年前的一篇文献报道说起,当时陶纬国从这篇文章中了解到外泌体和微囊的结构,“当我看到类似于纳米微粒的外泌体、微囊结构时,我认为可能会有磷酸化蛋白被包裹在外泌体中,然后进入血液。如果真是这样,被外泌体包裹的磷酸化蛋白可能会避免被血液中的磷酸酶水解。”于是陶纬国团队对血液中的外泌体、微囊进行了超速离心分离、提取,然后用质谱进行检测。一周以后,实验结果让所有人都惊呆了,他们从中发现了几千个磷酸化蛋白。这个突破性的发现使得临床科学家们今后可以在1毫升血浆里找到几千个磷酸化的位点,并从中筛选出不同疾病的生物标志物。之后,陶纬国团队对乳腺癌病人血清中的磷酸化蛋白做了研究,发现乳腺癌病人体内的磷酸化蛋白与其病症密切相关。 /p p   那么,磷酸化蛋白液体活检何时能够应用临床呢?陶纬国回答说:“虽然现在还不好断言,但我认为3-5年内都有可能。”他进一步解释,随着质谱技术的显著提升,一些原来检测不到的生物标志物现在能够检测了,后面的工作主要是考察重复性有多好,假阳性有多低。 /p p   谈及未来的工作,陶纬国表示,一方面会继续做乳腺癌的磷酸化蛋白生物标志物确认的工作 另一方面也会做其他疾病磷酸化蛋白生物标志物找筛的工作,“还有很多其它疾病,比如阿尔茨海默病、帕金森综合征等,也都是蛋白磷酸化有关。” /p p    span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 质谱用于生物大分子检测的思考 /strong /span /p p   陶纬国教授做蛋白组学研究至今已有十几年,用到的研究工具主要是质谱。在攻读博士期间,陶纬国师从普渡大学著名质谱专家Graham Cooks教授。博士毕业后,陶纬国加入了西雅图系统生物研究所,在Leroy Hood教授(自动DNA测序仪发明人)和Ruedi Aebersold教授(著名蛋白质组学专家)课题组继续博士后研究。从那时起,陶纬国就开始了他的磷酸化蛋白质组学检测的研究,“重回普渡教书以后,我的工作基本上是围绕着怎么去提高磷酸化蛋白分析手段来开展的。质谱在我的工作扮演着中心角色,包括方法开发,蛋白生物标志物早筛,全靠质谱来做。”首先是早筛,用质谱(Orbitrap)筛选出相关的生物标志物(磷酸化蛋白) 然后对病人的样本进行检测,用统计学的方法对检测结果进行分类 最后,分析统计学上有意义的、跟病人相关的磷酸化蛋白。 /p p   在过去二三十年里,质谱在生物大分子检测方面有几个重要的技术突破。首先,80年代末90年代初, ESI和MALDI的出现,使质谱能够用于分析生物样品 第二,近十几年来,高分辨质谱的飞跃发展,大大提升生物大分子的分析效率。“我读博士后时(2002年),很多仪器还是低分辨的,生物样品还是挺难做的,做完一个磷酸化的蛋白,单是数据库检索就要三天,而且,相对来说,得到的数据假阳性高。现在的高分辨质谱解谱很容易,差不多半个小时就够了,假阳性也降低很多。”此外,陶纬国还说到,“UPLC与质谱的结合在技术上是很大的进步,使色谱的分离效率赶上了质谱的速度,现在一个小时能检测到几千个蛋白,非常快。” /p p   同时,陶纬国也指出了目前利用质谱来检测生物大分子的难点。第一,生物样品基体复杂。“像我们实验室做磷酸化蛋白,它本身丰度就很低,假如样本不经过任何分离的话,谱图上将会只能看到高丰度蛋白。”第二,质谱检测假阳性比较高。“其实还是需要统计学算法方面的开发,来解决假阳性率高的问题,这也是现在很多质谱开发者在做的工作。” /p p   现如今质谱产品更新迭代非常快,对于质谱工作者来说,是好,也是坏。“新产品的确扫描速度更快了,精度更高。但是,也给质谱工作者带来了不小的压力。特别是像我们这种使用高分辨大仪器的,没有那么多钱换来换去。可是如果你想要紧跟前沿,这些新仪器又十分必要。”陶纬国说,这是目前质谱工作者普遍面临的两难境地。 /p p    span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 整合临床大数据 /strong /span /p p   2017年,陶纬国作为海外高层次人才被东南大学引进回国。谈及回国的初衷,陶纬国表示,国内拥有更多、更丰富的病人样本,这是他选择回国的原因之一。此外,国内对于高分辨质谱等大型仪器的投入力度也更大,有助于前沿研究的开展。谈到选择东南大学的原因,陶纬国说到:“东南大学的生物医学工程学院有转化医学,有生物,然后又有工程,包括产业化,比较适合我。” /p p   现在国内,整合医学大数据来服务大健康的概念很热,“在全国,包括南京,都已经有相关工作在开展”。从临床检测这个角度来说,陶纬国希望找到办法来整合DNA检测,microRNA检测,磷酸化蛋白检测几个维度的数据,从而获得更为精准的临床诊断结果。“比如检测一个肿瘤,通过对DNA、mRNA、磷酸化蛋白、糖基检测多维度数据的不断积累,数据会越来越多,结合人工智能、计算机算法,检测结果会越来越精准。 我回来能赶上这个机会也是不容易。”陶纬国如是说到。 /p p   目前,医学大数据的采集方式主要为第二代、第三代测序。“但是,质谱也是很重要的一块儿。”陶纬国指出,“比如乳腺癌,基因突变仅仅代表一种患病的可能性,但是到底有没有癌症还是要通过蛋白检测来确定,所以用质谱来检测蛋白的存在、活性、功能,比基因层面更可靠。所以,质谱检测肯定会慢慢跟上来。” /p p   陶纬国在东南大学生物医学工程学院的新实验室是电子生物国家重点实验室。对于自己的工作重心,陶纬国表示,现在是过渡时期,未来会逐步将重心转至国内。“国内实验室刚刚开始,看起来前途光明。” /p p   span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong  热衷学界公益事务 出任CASMS主席 /strong /span /p p   作为质谱生物大分子检测方面的专家,陶纬国于2017年6月份当选北美华人质谱学会(CASMS)主席。该学会汇聚了众多顶尖的华人质谱学者,已经成为质谱学界重要的华人力量。在一年一度的“美国质谱年会(ASMS)”期间举行“北美华人质谱学术会议”已经成为CASMS的传统。据陶纬国介绍,CASMS已有二三十年的历史,目前注册人数在800人左右,覆盖了北美地区绝大部分优秀的华人质谱学者。ASMS每年参会人数6000-7000人,相当一部分是华人,中国面孔越来越多。“在美国,有很多华人学者做了非常出色的工作,但他们并没有获得相匹配的影响力和威望。” 陶纬国说,“我们学会的宗旨就是提升华人质谱学者在世界质谱领域的影响力。当然, 中国本身的国际地位的重要性是显而易见的。” /p p   CASMS的另一个宗旨是促进世界华人质谱界的互相交流。每两年召开一次的“世界华人质谱学术研讨会”是全世界华人的质谱盛会,汇聚了中国内地、台湾、香港、新加坡和北美地区的质谱学者,CASMS是该会议4个主办方之一。2016年,CASMS主办了第六届“世界华人质谱学术研讨会”,这是该会议首次在美国召开,恰逢该会议召开十周年。“我认为非常有意义,促进了两岸三地华人质谱学者的交流合作。我的亲身体会是通过这个会议结识了很多优秀学者,而在此前很多同仁相互间是不认识的。” /p p   未来,除了重要的线下会议组织工作,陶纬国希望通过加强线上日常交流,来使学会内部联系更为紧密。 /p p    span style=" font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai " strong 后记: /strong 临床质谱技术被认为是医学诊断的下一个“基因测序”,应用前景被普遍看好。质谱用于临床检验具有灵敏度高、特异性高、重现性好的优点,可在临床多个领域对传统诊断方法学进行替代。陶纬国教授团队的磷酸化蛋白研究进一步提升了临床质谱应用的含金量。基于该研究,临床科学家们将会找到更多可靠的疾病标志物,从而实现癌症等重大疾病的早期发现和精准诊断。 /span /p p style=" text-align: right " 采访编辑:李博 /p
  • ​整合结构质谱法和计算模拟法探究糖原磷酸化酶中磷酸化介导的蛋白变构调控和构象动态性
    大家好,本周为大家介绍一篇本课题组发表在ACS Chem. Biol.上的文章,Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling1。变构调节在自然界中广泛存在,可以用于调控细胞过程。糖原磷酸化酶(GP)是第一个被鉴定出的与变构调节相关的磷酸化蛋白。GP是一个分子量约196kD的同源二聚体蛋白,是糖代谢中重要的组分,也是2型糖尿病及癌症的靶点。AMP结合以及Ser14的磷酸化介导了GP的变构调节,使其构象从非活化的T-state GPb(未磷酸化状态)转变为活化的R-state GPa(磷酸化状态)。即使目前X-射线晶体学法解析出了GP的原子级蛋白结构,但受限于较大分子量,其结构动态性的检测较为困难,因此与GP变构调节相关的结构动态变化过程仍较为模糊。核磁共振(NMR)谱及分子动力学(MD)模拟等是探究蛋白质结构动态性的常用方法,但NMR分析存在分子量上限,且样品消耗量大,MD模拟的时间尺度和力场准确度有限。质谱(MS)法具有快速、灵敏的特点,是蛋白质结构、动态性以及构象变化分析中强有力的一款技术。氢氘交换质谱(HDX-MS)通过监测蛋白骨架酰胺氢原子与溶液中氘的交换来反映蛋白质构象动态性,因此适用于探究由配体、蛋白结合或共价修饰引起的蛋白质构象变化。同时,多个软件实现了由HDX-MS数据计算保护因子(PFs)和吉布斯自由能,从而提取残基水平的蛋白动态性信息。此外,在先前的工作中2, 3,我们整合了native MS和top-down方法(native top-down,nTD-MS技术),成功实现了多个蛋白复合物的一级序列到高阶结构等多方面信息的检测(包括测序、翻译后修饰、配体结合、结构稳定性、朝向等)。整合多种结构质谱法(整合结构质谱法)可以有效填补传统生物物理法中结构到动态性联系中的空缺,更好地表征变构调控现象。本文整合了HDX-MS、nTD-MS、PF分析、MD模拟以及变构信号分析检测了磷酸化介导的GP变构调控的结构和动态性基础,为GP的变构调控过程提供了见解。根据X-射线晶体学结构报道(图1a),T-state GPb转变为R-state GPa时,二聚体界面中N-末端尾部、α2、cap’(图1b)以及tower-tower helices区(图1c)发生了明显的结构重排,导致催化位点开放,从而底物磷酸吡哆醛(PLP)可以结合。尽管有晶体学报道,但与变构调控关联的构象动态性仍有待探寻。图1.(a)磷酸化介导T-state GPb(PDB:8GPB)向R-state GPa(PDB:1GPA)的构象转变;亚基相互作用界面:(b)C端区域和(c)tower-tower helices,GPb为蓝色,GPa为绿色。首先我们通过nTD-MS进行了检测。如图2a、b,谱图中观察到了GPb的单体和二聚体信号,其中二聚体为主要形式;GPa除了单体和二聚体外,谱图中还存在少量四聚体,但仍以二聚体为主要形式。当增加sampling cone(SC)电压时,GPb、GPa保留了其二聚体形式(图2c、d)。随后我们选择离子(29+)并在trap池中进行了碎裂(图2e、f、g、h),谱图低质荷比区GPa的碎片相对峰强度较GPb高,说明GP的二聚体互作界面较为稳定,且GPb亚基结构较GPa稳定。nTD-MS不仅能够探究GPb、GPa的结构差异,也能够为接下来的HDX-MS实验做好前期样品质量检查工作。图2.不同活化条件下GPb、GPa的nTD-MS谱图。(a、b)SC=40V;(c、d)SC=150V;(e、f)SC=150V、trap=100eV;(g,h)SC=150V、trap=200eV。左侧为GPb,右侧为GPa。随后我们进行了HDX-MS实验。图3a中展示了五个时间点的HDX heat map。图3b为通过PyHDX软件计算产生的PF值。其中N-端(1-22)以及tower helix前的loop区域(256-261)的氘代值较高、PF值较低,说明这些区域较为柔性或是结构较为无序。此外我们发现,tower-tower helices(262-276)区域的氘代值较低、PF值较高,表明helices的旋转可能是由前端可塑性铰链区触发的,而非helices本身的变形和重塑引起的,这些发现在晶体结构数据中均有吻合之处。除这两个区域外,GPa和GPb基本保持了稳定的整体结构。而从1μs原子级MD模拟计算得到的均方根波动(RMSF)和溶剂可及表面(SASA)中我们也发现(图3c),这两个区域数据与HDX-MS信息有所吻合,但MD模拟中部分区域未和HDX-MS相吻合的区域可能跟序列覆盖不足相关。图3. (a、d)GPb和GPa在不同标记时间下的氘代热图并映射到结构中(PDB: 1GPA)。(b、e)基于HDX-MS数据计算得到的PF值并映射到晶体结构中。(c、f)MD模拟中RMSF和SASA值并映射到结构中。从氘代差异图(图4a)中可以看出,4个区域呈氘代降低趋势(红色方框),多个区域呈氘代上升趋势(蓝色方框)(GPa-GPb)。而PF差的变化趋势与氘代变化趋势基本一致(图4b)。由数据可知,N-端和tower-tower helices的变化说明磷酸化介导的变构稳定了这两个区域,α1-cap-α2区域的动态性轻微下降。除此之外多个区域(尤其是tower-tower helices序列后的区域)均表现为PF值下降,说明相比于GPb,GPa催化位点附近的区域动态性增强了。接下来我们根据HDX kinetic plot特征将其进行了分类,并详细讨论了所属区域的变化。图4.(a)GPa-GPb HDX-MS的氘代差异图。(b)GPb到GPa PF的变化。 首先是N-端和C-端的变化(图5)。N-端残基1-22表现氘代下降,这说明N-端具有一定可塑性。受N-端区域磷酸化和结构变化影响,C-端区域也产生了一定的变化。此外,残基30-50(cap区)和残基111-117(α4back-loop)区表现氘代下降,而103-109(α4front)表现氘代上升。根据晶体结构推测,cap区和α4back-loop的氘代变化受N-末端变化影响,原有的残基相互作用被打破,形成新的残基间相互作用,同时这两个区域也经历了结构重排,因此表现出较明显的氘代变化。残基88-99(β2-α3)和残基125-141(β3-L-α6)氘代上升。总的来说,磷酸化使得cap′/α2界面互作增强了,同时磷酸化基团和精氨酸残基的静电相互作用是cap区产生变化的主要原因,而α1和α2起到锚定作用,其相对位置基本保持不变。图5.GPb(a)和GPa(b)的N-端和C-端区域的局部结构和HDX动力学曲线(c)。 此外,tower-tower helices(α7,残基262-278)区的变化同样值得关注(图6)。250s loop是表面暴露区域,未与其他区域发生接触,其氘代下降可能是因为自身结构的收缩。而肽段262-267和268-274氘代下降提示该区域可能发生了低周转率或强互作的结合反应。280s loop区氘代值上升。这些变化均说明,tower-tower helix的角度的改变不仅影响了二聚体界面结构,而且还影响了其靠近催化位点的周围区域。因此我们结合晶体结构推测,磷酸化和N-端相对位置的改变,使250s loop自身结构收缩,从而打破了Tyr262' -Pro281和Tyr262-Tyr280′之间的相互作用,导致两个亚基的tower helices发生相对滑动,倾斜角度增加。图6.GPb(a)和GPa(b)tower helix区域的局部结构和HDX动力学曲线(c)。 最后是催化位点、PLP结合位点和糖原存储位点的变化情况(图7)。催化位点周围多数区域均表现氘代上升趋势。我们推测,随着Pro281、Ile165和Asn133间的相互作用被打破,Arg569与Ile165、Pro281、Asn133间的互作也随之打破,因此催化位点和PLP结合位点周围的残基溶剂可及性上升,局部区域结构变得更为灵活,催化位点开放并转变为活化构象。糖原储存位点位于GP表面,距离催化位点30Å,除了α23(残基699−708)外,HDX-MS在糖原存储区没有观察到明显的变化。图7.GPb(a)和GPa(b)的催化位点和PLP(橙色)结合位点的局部结构和HDX动力学曲线(c)。结合以上所有数据,我们对磷酸化调节的动态机制进行了推测(流程图1)。磷酸化后,N-端尾部残基与acidic patch的互作被打破,也导致N-端尾部的有序化以及C-端尾部的无序化以及伴随的其他结构变化。通过在pSer14和Arg69和Arg43′之间形成新的盐桥,N-端残基被重定位,随之带来的是Asp838和His36′间的盐桥断裂。随着三级和四级结构的转变,250s loop收缩并发挥类似“门环”的作用,当其收缩时,Tyr262′-Pro281与Tyr262-Tyr280′之间的相互作用、276-279区与162-164区之间的氢键也被打破,导致tower helix发生相对滑动,tower-tower helices之间的作用被打破,同时将结构变化传递到催化位点。最后,280s loop和催化位点以及PLP结合位点附近的残基松动,通往催化位点和底物磷酸盐识别位点的通道打开,酶得以活化。流程图1.GP变构调节过程中,被打破(蓝色)或新形成的(红色)关键残基相互作用。 本文整合nTD-MS、HDX-MS、PF分析和MD模拟检测了GP磷酸化变构调节过程的结构和动态基础,通过该整合结构手段揭示了GP构象柔性、局部动态性以及长程变构调控构象变化中值得关注的信息。各个方法具有各自的优势,但也在一定层面存在局限,我们期待将HDX-MS信息与计算模拟信息进行更深度的整合以实现二者对蛋白质结构更精确的分析。撰稿:罗宇翔编辑:李惠琳原文:Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics of Glycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling李惠琳课题组网址:https://www.x-mol.com/groups/li_huilin参考文献1. Huang, J. Chu, X. Luo, Y. Wang, Y. Zhang, Y. Zhang, Y. Li, H., Insights into Phosphorylation-Induced Protein Allostery and Conformational Dynamics ofGlycogen Phosphorylase via Integrative Structural Mass Spectrometry and In Silico Modeling. ACS Chem. Biol. 2022.2. Li, H. Nguyen, H. H. Ogorzalek Loo, R. R. Campuzano, I. D. G. Loo, J. A., An integrated native mass spectrometry and top-down proteomics method that connects sequence to structure and function of macromolecular complexes. Nat. Chem. 2018, 10 (2), 139-148.3. Li, H. Wongkongkathep, P. Van Orden, S. L. Ogorzalek Loo, R. R. Loo, J. A., Revealing ligand binding sites and quantifying subunit variants of noncovalent protein complexes in a single native top-down FTICR MS experiment. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2014, 25 (12), 2060-8.
  • 我国磷酸化蛋白质组分析技术获得新进展
    在国家自然科学基金的大力支持下(项目资助号:21021004),中国科学院大连化学物理研究所邹汉法研究员在磷酸化蛋白质组分析技术方面获得新进展,相关成果发表在最近一期的Nature Protocols上(2013,8,461-480)。(http://www.nature.com/nprot/journal/v8/n3/abs/ nprot.2013.010.html)。   固定化金属离子亲和色谱(IMAC) 是磷酸化蛋白质组学研究中最常用的磷酸化肽段富集技术之一,常规的IMAC使用的螯合基团有三羧甲基乙二胺、次氨基乙酸、亚氨基二乙酸等,在螯合铁、镓等金属离子后可用于磷酸肽的富集。其缺点是特异性不高,在富集磷酸肽的同时也富集了一些酸性肽。研究人员发现了磷酸酯锆或钛表面与磷酸肽之间的高特异性相互作用,并利用这一相互作用建立了以磷酸基团为螯合配体的新一代固定化金属离子亲和色谱技术。实验表明,该新型IMAC对磷酸肽富集的特异性优异,可以有效避免酸性肽段的非特异性吸附。与传统的IMAC相比较,其对磷酸肽的富集能力提高3-10倍,从而大大提高了蛋白质磷酸化分析的检测灵敏度和鉴定覆盖率。该新型IMAC方法自2006年发表首篇论文以来,已在Mol. Cell. Proteomics, J. Proteome Res., Anal. Chem.等蛋白质组学与分析化学权威期刊发表论文20余篇,其中2007年发表在Mol. Cell. Proteomics的一篇论文已经被引用110余次。采用该方法为核心技术进行了人类肝脏蛋白质磷酸化的规模化分离鉴定,建立了迄今为止国际上人类肝脏蛋白质磷酸化的最大数据集 (Mol. Cell. Proteomics,2012,11,1070-1083)。

质谱检测蛋白磷酸化位点方法相关的方案

  • 人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)检测试剂盒
    人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)检测试剂盒人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围: 规格:96T/48T使用目的:本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗原、生物素化的人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度
  • LTQ-Velos-Pro-Orbitrap-Elite在磷酸化蛋白质组学中的应用
    从上述结果可以得出,LTQ-Velos-Pro-Orbitrap-Elite检测结果可靠性高,系统稳定性高,质谱质量轴稳定性高,在短时间内可以鉴定到大量高可信的磷酸化修饰肽段以及磷酸化位点,可以很好的应用于磷酸化蛋白质组学研究,同时本次实验还说明对样本使用TiO2进行多次重复富集可以显著提高样本中磷酸化肽段的比例,提高磷酸化肽段与位点的鉴定数目。
  • 基于二氧化钛富集策略的人类磷酸化蛋白质组大规模鉴定
    在这部分工作中,我们采用了高 pH 反相色谱结合二氧化钛富集以及二氧化钛富集结合强阳离子交换分级两条技术路线来对实现对 Hela 细胞的磷酸化蛋白质组的深度覆盖。最终我们的实验一共鉴定到了 8,696 个蛋白质上的近 40,000 个磷酸化位点。 在二氧化钛富集结合强阳离子交换分级的技术路线中,SCX 分级的梯度还值得进一步优化,对于这种组分较少的预分级方法,阶梯洗脱会是一个更好的选择。这种大规模的磷酸化肽段富集方法对样品的起始量要求比较高,如果样品较少的话,建议采用二氧化钛富集结合强阳离子交换的策略,一般 2 mg 起始蛋白就能得到较多的磷酸化位点鉴定。ThermoFisher也提供了商业化的 IMAC 试剂盒(Cat # 88300),鉴于 IMAC 和 TiO2 对磷酸化肽段富集有着较好的互补性,这两者联用会对磷酸化蛋白质组的深度覆盖达到更好的效果。

质谱检测蛋白磷酸化位点方法相关的资料

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  • 【转帖】磷酸化蛋白质及多肽相关研究的技术进展

    磷酸化蛋白质及多肽相关研究的技术进展 摘要磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰,对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点,对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破,磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。关键词磷酸化蛋白磷酸化肽生物质谱定量分析生命活动与蛋白质的动态变化密切 摘要 磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰, 对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点, 对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破, 磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。 关键词 磷酸化蛋白 磷酸化肽 生物质谱 定量分析

  • 含多个磷酸化位点的多肽的合成

    生命活动与蛋白质的动态变化密切相关, 很多情况下某些蛋白质是通过各种翻译后修饰来完成或改变其功能。在数量众多的蛋白质翻译后修饰中,蛋白质磷酸化修饰无疑是最重要的一类,它是指通过蛋白激酶(Protein kinase,PK)介导的酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程(Figure 1所示),是生物体内存在的一种普遍的调节方式。现今发现的所有人类蛋白质中超过30%可被磷酸化修饰,这一修饰在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位,与生命活动的许多过程都密切相关,对此的研究已经成为蛋白质科学的热点之一。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918444_small.jpg磷酸化多肽(主要指肽链中的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的侧链羟基被磷酸化生成酸式磷酸酯的修饰多肽)是研究蛋白质磷酸化过程的必不可少的工具,它可作为磷酸酶模型底物,或作为可产生抗磷酸化蛋白抗体的抗原,也可以在确定磷酸化蛋白的物理参数时作为参考化合物等。因此磷酸化多肽的合成在过去的几年中吸引了相当大的兴趣,目前已确定了较为成熟的合成路线,使磷酸化多肽的合成趋于常规。目前磷酸化多肽的合成主要有两个策略:后磷酸化法(Global phosphorylation)和单体法(Building block approach),如Figure 2所示。前者是在多肽序列合成结束后再在固相载体上对丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的侧链羟基进行磷酸化,可以在同一次合成中同时得到带有和不带有磷酸化位点的多肽;而后者则将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中,操作较前者更为简单,现已成为磷酸化多肽合成的首选策略。在采用单体法构建磷酸化多肽时,目前广泛采用的原料为侧链单苄基保护的氨基酸:Fmoc-AA(PO(OBzl)OH)-OH (AA = Ser, Thr or Tyr)。这类保护的磷酸化位点由于侧链磷酸化基团的离子化而产生较大的位阻效应,并且磷酸化位点的引入往往能促进肽链二级结构的形成,故而磷酸化位点及其后的氨基酸的引入会比较困难。这些问题在合成含有多个磷酸化位点的多肽时将会变得尤为严重,往往会使最终产物的组成非常复杂,难以进行纯化,甚至直接导致合成的失败。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918477_small.jpg一般来讲,增加投料量和延长反应时间都能促使连接反应趋于完全,但增加投料量无疑会提高合成成本,对于较昂贵的带有保护的磷酸化氨基酸更是这样,而延长反应时间则可能增加其它副反应发生的风险,故而在合成磷酸化多肽时,需要对氨基酸投料量、反应方法以及反应时长等进行优化调整以期达到更理想、更经济的合成效果。我们有针对性地对磷酸化多肽合成条件进行了探索和调整,采用最终的优化条件成功合成了含有多达六个磷酸化丝氨酸残基的多肽:FAM-Ahx-X(pS)XX(pS)X(pS)X(pS)XX(pS)X(pS)-NH2(客户肽,详细序列未给出;其氨基端标记FAM以进行荧光检测),经过RP-HPLC纯化后最终纯品的纯度高达95%(见Figure 3)。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918493_small.jpg参考文献:1. P. Cohen, “The Role of Protein Phosphorylation in Neural and Hormonal Control of Cellular Activity”, Nature, 1982, 296 (5858): 613-620.2. From: http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_kinase.3. L. A. Pinna, A. Donella-Deana, “Phosphorylated Synthetic Peptides as Tools for Studying Protein Phosphatases”, Biochim. Biophys. Acta., 1994, 1222 (3): 415-431.4. W. C. Chan, P. D. White, “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach” (2000), Oxford University Press.

  • 个性化定制:专属于您的磷酸化抗体

    [font=宋体]磷酸化抗体是一种特殊的抗体,能够识别并结合到已经被磷酸化的蛋白质。磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式,通过将磷酸基团结合到特定的氨基酸残基上,可以改变蛋白质的结构和功能。在许多生物学过程中,磷酸化都扮演着重要的角色,因此磷酸化抗体成为了研究生物学和生物化学的重要工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白质磷酸化是指蛋白在激酶作用下在特定氨基酸位点(最常见的是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基)发生磷酸化的过程。蛋白磷酸化是极其重要的翻译后修饰,其动态调控是信号转导中不可或缺的一环,调控着细胞生长、分化、代谢、凋亡等等过程。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]磷酸化抗体主要是针对磷酸化位点制备的,可以特异性识别磷酸化氨基酸位点,对磷酸化蛋白进行定性、定量分析,检测蛋白受刺激后磷酸化水平变化情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州可以为客户提供一系列具有高特异性(经内源性、磷酸化特异性等多方面验证)、高灵敏度([/font][font=Calibri]1:200000[/font][font=宋体]稀释度)特点的磷酸化抗体,满足[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]等应用。同时我们还可以为客户提供定制化的磷酸化抗体定制服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]义翘神州磷酸化抗体服务优势:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①专业高效的多肽设计软件及高效偶联方法,保证多肽免疫成功率[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]以上。[/font][/font][font=宋体]②多种纯化策略,正负筛选平台,确保得到高特异识别指定磷酸化位点的抗体。[/font][font=宋体]③竞争性的价格[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供多种生物的制备服务,包括磷酸化兔多克隆抗体制备服务、磷酸化鼠单克隆抗体制备服务、磷酸化兔单克隆抗体制备服务[/font][font=宋体]……详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/phospho-specific-antibody-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之,义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/services/phospho-specific-antibody-service][b]磷酸化抗体定制服务[/b][/url]能够满足您的个性化需求,帮助您在研究领域获得更多的突破。我们致力于为您提供高质量、高效率的抗体定制服务,助力您的科研事业更上一层楼。[/font]

质谱检测蛋白磷酸化位点方法相关的耗材

  • 人磷酸化Tau-181蛋白 (pTau-181)检测试剂盒
    国内外多项研究表明血浆pTau-181可以作为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的早期生物 标志物,有效区分AD痴呆与非AD痴呆的神经退行性疾病,但是由于受到血脑屏障的限制,外周血 中脑源性蛋白的浓度较低,且易受到血浆基质蛋白的干扰。彩科(苏州)生物科技有限公司所开发单分子免疫检测平台,使用彩科生物人磷酸化Tau181蛋白(pTau-181)检测试剂盒,在彩科生物AXL/SXL 单分子阵列免疫分析仪上可以定量检测血浆中pTau181的蛋白浓度
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    产品特点: 专门设计用于对复杂样品中的磷酸化肽进行高选择性的浓缩和富集,这个kit包括一块装填了亲和填料的&mu Elution 96孔板和独特的试剂En hancerTM,可以进一步提高磷酸化肽的选择性;适合从蛋白质组样品中有选择性地富集磷酸化肽,富集效率高。 ■ &mu Elution 96孔板是不同于固定化金属亲和层析原理的亲和色谱吸附剂 ■ 使用简便,不需要用金属螯合试剂对前处理小柱进行活化 ■ &mu Enhancer&trade 试剂进一步加强96孔&mu Elution提取板对磷酸化肽的选择性 ■ 满足高通量应用需求 订货信息: 产品描述 部件号 MassPREP磷酸化肽浓缩处理包,包括 186003864 MassPREP磷酸化肽富集 &mu Elution 96孔板, 1 /包 186003820 MassPREP Enolase/磷酸化肽标准品 186003286 MassPREP Enhancer,10 units/kit,500 mg 186003821 MassPREP Enhancer,5 units/kit,500 mg 186003863
  • GL-Sciences(技迩) Titansphere TiO 二氧化钛填料 其他色谱配件
    Titansphere TiO 二氧化钛填料Titansphere TiO填料,是将二氧化钛(TiO2)做为骨架结构的全新型HPLC用球状二氧化钛凝胶填充剂. 是唯一一款产业化了的二氧化钛凝胶色谱填料.以下为二氧化钛色谱填料。Titansphere TiO填料是一种在碱条件下也同样能够使用的,与硅胶有着不同吸附特性的填充剂。其主要特点如下:表面、形状平整的球状二氧化钛凝胶表面积比较大选择性保留磷酸化合物优异的结构异构体分离能力优异的耐酸、耐碱性磷酸化肽的精制和浓缩细胞中的磷酸化蛋白质,其存在量为微量且离子化效率低,因此质谱(MS)检测比较困难。但是,如果使用以二氧化钛(二氧化钛:TiO2)形成的均一多孔质球状粒子TitansphereTiO,则可从蛋白质酶切物中选择性地浓缩精制磷酸化肽,使MS检测变得容易。操作方法全部为离心操作,几乎没有人为误差。处理时间约40分钟,可在短时间内完成精制? 浓缩。磷酸化肽选择的精制浓缩珠Titansphere TiO 填料是能够选择性地精制 浓缩磷酸化肽的高性能填料。使用拟南芥细胞提取物,与市售IMAC 进行了比较,磷酸化肽的总峰面积约2.6 倍、肽鉴定数约1.8 倍,可检测到大部分磷酸化肽。订货信息:Titansphere TiO 二氧化钛填料品 名数 量产品编号Titansphere TiO 5μm500mg/P5020-75000Titansphere TiO 10μm500mg/P5020-75010EmporeTM Disk C8 直径 47mm、膜厚 0.5mm20/P5010-30002EmporeTM Disk C8 直径 90mm、膜厚 0.5mm10/P5010-30003
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