观察器

应用专家 易海英 荧光现象荧光是指荧光物质在特定波长光照射下，几乎同时发射出波长更长光的过程(图1)。当特定波长(激发波长)的光照射一个分子(如荧光团中的分子)时，光子能量被该分子的电子吸收。接着，电子从基态(S0)跃迁至较高的能级，即激发态(S1’)。这个过程称为激发①。电子在激发态停留10-9–10-8秒，在此过程中电子损失一些能量②。电子离开激发态(S1)并回到基态的过程中③，会释放出激发过程中吸收的剩余能量。荧光分子在激发态驻留的时间为荧光寿命，一般为纳秒级别，是荧光分子本身固有的特性。利用荧光寿命进行成像的技术叫荧光寿命成像(Fluorescence Lifetime Imaging，FLIM)，可以在荧光强度成像之外，更加深入地进行功能性精准测量，获取分子构象、分子间相互作用、分子所处微环境等常规光学成像难以获得的信息。荧光的另一个重要特性是Stokes位移，即激发峰和发射峰之间的波长差异（图2）。通常发射光波长比激发光波长更长。这是由于荧光物质被激发之后、释放光子之前，电子经过弛豫过程会损耗一部分能量。具有较大Stokes位移的荧光物质更易于在荧光显微镜下进行观察。图2：Stokes位移荧光显微镜及荧光滤块荧光显微镜是利用荧光特性进行观察、成像的光学显微镜，广泛应用于细胞生物学、神经生物学、植物学、微生物学、病理学、遗传学等各领域。荧光成像具有高灵敏度和高特异性的优点，非常适合进行特定蛋白、细胞器等在组织及细胞中的分布的观察，共定位和相互作用的研究，离子浓度变化等生命动态过程的追踪等等。细胞中大部分分子不发荧光，想要观察它们，必须进行荧光标记。荧光标记的方法非常多，可以直接标记（比如使用DAPI标记DNA），或利用抗体抗原结合特性进行免疫染色，也可以用荧光蛋白（如GFP，绿色荧光蛋白）标记目标蛋白，还可以用可逆结合的合成染料（如Fura-2）等。图3：Leica DMi8倒置荧光显微镜及滤片转轮目前荧光显微镜已成为各个实验室及成像平台的标配成像设备，是我们日常实验的好帮手。荧光显微镜主要分为三大类：正置荧光显微镜（适合切片）、倒置荧光显微镜（适合活细胞，兼顾切片）、荧光体视镜（适合较大标本，如植物、斑马鱼（成体/胚胎）、青鳉、小鼠/大鼠器官等）。荧光滤块是显微镜荧光成像的核心部件，由激发滤片、发射滤片和二向分光镜三部分组成，安装在滤片转轮里，如Leica DMi8配有6位滤片转轮（图3）。不同的显微镜转轮位数会有区别，也有些显微镜使用滤块滑板。滤块在荧光成像中起着重要作用：激发滤片选择激发光来激发样品，阻挡其他波长的光；通过激发滤片的光经过二向分光镜（其作用是反射激发光和透射荧光），反射后通过物镜聚焦，照射到样品，激发出对应的荧光即发射光，发射光被物镜收集，透过二向分光镜，到达发射滤片。如图4中：激发波长为450-490nm，二向分光镜反射短于510nm的光、透过长于510nm的光，发射光接收范围为520-560nm。图4：荧光显微镜光路图荧光显微镜常用荧光滤块可分为长通（long pass，简称LP）和带通（band pass，简称BP）两种类型。带通通常由中心波长和区间宽度确定，如480/40表示可通过460-500nm的光。长通滤色片如515 LP，表示可以通过波长长于515nm的光（图5）。图5：FITC光谱曲线及滤片荧光物质具有其特征性激发（吸收）曲线和发射曲线，激发峰为最佳激发波长（激发效率最高，从而可以降低激发光能量，保护细胞和染料），发射曲线为发射荧光波长范围。因此，在实验中，我们会尽可能选择与激发峰最接近的波长进行激发，而接收范围需包括发射峰。如Alexa Fluor 488的激发峰为500nm，在荧光显微镜中可以选择480/40的激发滤片。图6：Alexa Fluor 488光谱曲线滤块的详细信息可以在显微镜成像软件里看到。了解染料并找到最匹配样品的滤块对于荧光成像有着至关重要的作用。荧光染料和荧光蛋白的光谱信息一般在说明书中会注明，也可在网上查阅（如https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/、https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-proteins-introduction-and-photo-spectral-characteristics/）。滤块的选择除考虑荧光探针的激发、发射波长，对于多色标记样品还需考虑是否有非特异激发、是否串色。此外还需考虑所使用的荧光光源，目前常用的荧光光源有汞灯、金属卤素灯，以及近年来飞速发展的LED光源。荧光光源的光谱有连续的和非连续的，在不同波段能量也会不同。LED光源因为其相对较窄的光谱带、更稳定的能量输出、超长的寿命、更安全环保等诸多优点，正逐步成为荧光显微镜的主要光源。除了显微镜内置的滤块，还有外置快速转轮（图7），徕卡的外置快速转轮相邻位置滤片转换速度为27ms，可实现高速多色实验，如FRET及Fura2比例钙成像（图8）等。图7：徕卡外置快速转轮EFW图8：钙成像，Fura2, Cultured hippocampal astrocytes from 18-day-old embryos of Sprague-Dawley rats. Courtesy of: Drs. Kazunori Kanemaru and Masamitsu Iino, Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo 丰富多样的荧光显微成像技术为了满足不同的荧光成像需求，除荧光显微镜外，还发展出了各种荧光显微成像解决方案：? 宽场高清成像系统，如Leica THUNDER Imager，采用Leica创新的Clearing专利技术，在成像时高效去除非焦平面干扰信号，呈现清晰图像，同时兼有高速成像的优点；? 共聚焦激光扫描显微镜，利用针孔排除非焦平面干扰，实现光学切片，得到高清图像及三维立体图像；? 突破衍射极限的超高分辨率显微镜及纳米显微镜，可对小于200nm的精细结构进行观察；? 利用多光子激发原理进行厚组织及活体深层成像的多光子成像系统；? 具有高时空分辨率的光片成像技术，成像速度快、分辨率高、光毒性低，特别适合进行发育、活体动态观察等研究；? 荧光寿命成像(FLIM），不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响，能更加深入地进行功能性精准测量；? 荧光相关光谱(FCS)及荧光互相关光谱(FCCS），测量荧光分子的分子数、扩散系数，从而分析分子浓度、分子大小、粘性、分子运动、分子结合/解离、分子的光学特性等；? 全内反射荧光显微镜(TIRF)，极高的z轴分辨率，非常适合细胞膜表面的分子结构和动力学研究。 荧光显微成像技术应用广泛，种类丰富，而且新技术还在不断涌现，大家可以选择最适合的技术去完成自己的研究。

燃料电池是一种把燃料所具有的化学能直接转换成电能的化学装置，又称电化学发电器。它是继水力发电、热能发电和原子能发电之后的第四种发电技术。燃料电池的能量利用效率高，环境污染小，是最有发展前途的发电技术之一。燃料电池按照电解质的种类不同，可分为碱性燃料电池（AFC），磷酸燃料电池（PAFC），熔融碳酸盐燃料电池（MCFC），质子交换膜燃料电池（PEMFC）和固体氧化物燃料电池（SOFC）。按照燃料的类型可分为氢燃料电池，甲烷燃料电池，甲醇燃料电池，乙醇燃料电池。目前各类燃料电池电动车主要使用的是质子交换膜燃料电池（PEMFC）。质子交换膜燃料电池的结构和化学反应上图是PEMFC的结构和化学反应。PEMFC由膜电极（membrane-electrode assembly，MEA)和带气体流动通道的双极板组成。其核心部件膜电极是采用一片聚合物电解质膜和位于其两侧的两片电极热压而成，中间的固体电解质膜起到了离子传递和分割燃料和氧化剂的双重作用，而两侧的电极是燃料和氧化剂进行电化学反应的场所。PEMFC通常以全氟磺酸型质子交换膜为电解质，Pt/C或PtRu/C为电催化剂，氢或净化重整气为燃料，空气和纯氧为氧化剂，带有气体流动通道的石墨或表面改性金属板为双极板。膜电极（MEA）的截面SEM图片Sample: Courtesy of Prof. Takeo Yamaguchi, Tokyo Institute of Technology膜电极（Membrane Electrode Assembly ，MEA)是燃料电池的主要部分，它每层的结合情况以及颗粒的聚集状态会影响发电性能。MEA截面的结构观测非常重要。上图显示了一个聚合物膜样品在冷却时的横截面离子研磨后的结果，为减少离子束的热损伤使用了-100 ℃的条件进行加工。MEA横截面的整个图像显示各层接触时没有分层。在高倍放大时的阳极图像可以观察到纳米尺寸的铂粒子，碳粒子和其中的空隙。阴极层是纳米胶囊催化剂与铂铁纳米颗粒结合，从它的横截面可以看到，催化剂胶囊被紧密地包装在中空空间中。因此，离子研磨法可以在没有应力的情况下进行加工，能够通过冷却功能加工截面样品来减少热损伤，产生具有减少热损伤的横截面样品，进而可以有效的理解MEA的整体结构和分析催化剂颗粒的纳米结构。燃料电池催化电极材料高倍图像和三维重构结构from Prof. Chihiro Kaito, Ritsumeikan University上图左图是使用日立HT7830得到的燃料电池催化电极材料高倍图像，加速电压使用120kV，高分辨模式（HR mode），放大倍数为×50,000。C基底上的Pt颗粒的分散状态可以很清晰的看到。上图右图是同样的样品从+60°～-60°每2°拍照一次得到一系列图片后做三维重构后的结果，可以清楚的看到三维结构的Pt颗粒的分散情况。CNT和PTFE复合膜的SEM图像Sample：courtesy of Prof. Yoshinori SHOW Department of Electrical and Electronic Engineering,School of Engineering, Tokai University由于导电性和耐腐蚀性好，碳纳米管（CNT）和聚四氟乙烯（PTFE）复合膜有时会作为 MEA 的保护膜使用。CNT 在PTFE 中分散的均匀性非常重要，因为膜的导电性会受此影响。上图中，左图为0.2eV时观察CNT和PTFE的表面形貌，由于电压非常低，所以样品没有被电子束损伤。 右图为0.2eV时观察CNT和PTFE的电位衬度，CNT的亮度比PTFE明显要高，这是因为CNT的导电性更好。利用电位衬度就可以非常清晰的区分成分衬度相差不大的CNT和PTFE。燃料电池气体扩散层的电镜观察气体扩散层(Gas diffusion Layer，GDL)作为连接催化层和流动区域的桥梁，一般具有多孔性，导电性，疏水性，化学稳定性和可靠性。常用的支撑材料有碳纤维和聚四氟乙烯/碳膜组成的微孔层（MPL），目前碳纤维布附着MPL可以达到气体扩散层的要求。上图就是碳纤维布及附着MPL的SEM图片，可以观察到二者之间的紧密接触，各自空隙及厚度。高分辨观察自组装Fe3O4纳米颗粒Sample：courtesy of Electrical Computer Engineering department, National University of Singapore过渡金属基材料比如自组装Fe3O4纳米颗粒现在被作为储氢材料，这对氢能的利用来说是非常关键的。上图是高分辨观察自组装Fe3O4纳米颗粒，所用的着陆电压为1.5 kV，使用了电子束减速功能。纳米颗粒非常有规则的组装在一起，每个颗粒的直径约为12nm。利用电镜观察燃料电池各部分的形貌和结构，有助于高性能燃料电池的研发。公司介绍：日立科学仪器（北京）有限公司是世界500强日立集团旗下日立高新技术有限公司在北京设立的全资子公司。本公司秉承日立集团的使命、价值观和愿景，始终追寻“简化客户的高科技工艺”的企业理念,通过与客户的协同创新，积极为教育、科研、工业等领域的客户需求提供专业和优质的解决方案。 我们的主要产品包括：各类电子显微镜、原子力显微镜等表面科学仪器和前处理设备，以及各类色谱、光谱、电化学等分析仪器。为了更好地服务于中国广大的日立客户，公司目前在北京、上海、广州、西安、成都、武汉、沈阳等十几个主要城市设立有分公司、办事处或联络处等分支机构，直接为客户提供快速便捷的、专业优质的各类相关技术咨询、应用支持和售后技术服务，从而协助我们的客户实现其目标，共创美好未来。

从古至今，人类一直在追寻更高更远的真相，从远洋航行到太空探索，人们不断征服一个个宏伟的目标，但是人们肉眼所见的宏观世界不是世界的全部，还有人眼无法看清的微观世界，它同样也吸引着无数人去探索和追寻。无论宏观还是微观事物，我们的观测都是基于三维空间的属性，即XYZ三维，而对事物形态变化的观察则需要再引入一个衡量因素--时间T，因此对事物观察的最完备方式一定是XYZT的同时记录，即形态+时间的长时间摄影，这也是显微镜的终极功能。经过三百多年的发展，现代显微镜提出分辨率、景深、视野等概念，并不断提出解决方案，显微镜已经初步满足我们对微观世界观察的需求，帮助我们记录下微观世界的空间和时间。微观世界观察最重要的是细节的分辨，分辨率的概念便由此诞生，分辨率是指人眼可以区分的两个点之间的最小距离，只在XY维度有效，根据瑞利判据，Rayleigh Criterion，正常人能分辨的极限是明视距离25cm处0.2mm的两个点，当我们使用显微镜后，我们可以看清更小距离的两个点，这便提升了我们观察的分辨率。随着现代研究的不断深入，人们对分辨率的要求也在不断提高，而科学家们也在不断的提升显微镜的分辨率，如电子显微镜将分辨率提升至纳米级别，实现了对病毒的观察，超高显微成像技术，将显微镜的分辨率从200纳米提升到几十纳米，实现了对活细胞细胞器的观察。分辨率的提升也带来了新的问题，即视野和景深的减小，当用普通中央照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA，可见光波长范围为400—700nm，取其平均波长550nm，波长是固定常量，因此，增大NA数值，即可得到更小的D值，也就是可以分辨的两点之间的距离更小，可以让人眼看清楚更小的物体。NA值即数值孔径，描述了透镜收光锥角的大小，NA = n * sinα，即透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（2α）半数的正弦之乘积。n为物镜与样本之间介质的光折射率，当显微镜物方介质为空气时，折射率n = 1 , 采用折射率高于空气的介质，可以显著提高NA值，水浸介质是蒸馏水，折射率为1.33；油浸物镜介质是香柏油或其它透明油，其折射率一般在1.52左右，接近透镜和载玻片的折射率，因此，油镜的NA值高于空气镜。孔径角又称“镜口角”，是透镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度，增大镜口角，可以提高正弦值，其实际上限约为72度（正弦值为0.95），乘以香柏油折射率1.52，可以得出最大NA值为1.45左右，代入分辨率计算公式，可以得出常规显微镜极限XY平面分辨率为0.2um左右。NA值还会直接影响显微镜的视野亮度（B）。由公式B∝N.A.2/ M2 我们可以推出，亮度随数值孔径（N.A.）的增大或者物镜倍率（M）的降低而增加。从理论上来说，我们应该追求尽可能高的NA值，以获得更好的XY平面分辨率和视野亮度。然而凡事都有两面性，XY平面分辨率的提升，会带来Z轴景深和观察视野的减小。显微镜一般都是垂直向下取景的，通过视场直径内观察到的物体表面凸起的位置与凹下的位置都能够看的很清楚时，那么凸点与凹点之间的高度差就是景深了，对于显微镜来说景深越大越好，景深越大在观察高低不平整的物体表面时，能够得到更好更立体的清晰度画面，大景深有助于我们对微观世界进行垂直方向形态的观察，也就是XYZ三维形态中的Z轴信息。景深就是象平面上清晰的象所对应物平面的前后空间的深度：dtot=(λ*n)/NA + n/(M∗NA) * e，dtot：景深，NA ：数值孔径，M ：总放大率，λ：光波波长, （通常λ=0.55um），n: 试样与物镜之间介质的折射率（空气: n=1、油: n=1.52）根据这个公式，我们可以知道，Z轴景深与XY平面NA值成反比。除了景深外，视野也受到NA值的影响，通过仪器固定注视一点时所能看见的空间范围即视野，它的计算与物镜的放大倍数直接相关，观察所看到的实际视野直径等于视场直径除以物镜的放大倍数，目镜会表明对应视场数，如10/18，即放大倍数10倍，视场直径18mm，因此当目镜确定后，放大倍数越大则观察的视野越小。XY平面分辨率是对局部细节的解析，而视野则决定了我们对样本的观察范围，视野必然是越大越好，但受限于当前的技术，我们必须采用高倍物镜，才可以得到良好的NA值，因此,视野和NA值有间接的负相关系。当我们需要观察的样本大于我们的视野时，每次观察只能看到一个局部，为了解决这个问题，拼图技术便应运而生。通过在XY方向移动样本，连续拍下不同位置的图像，最后拼接在一起，就可以得到一张全视野的图像。▲镜下局部视野▲拼接后全视野▲手动拼接▲自动拼接(图源：Echo显微镜)拼接分为手动和自动两种，手动拼图成本低廉，但是对人员的操作水平，经验要求很高，如上图，操作人员稍有不慎，就会出现图片接缝问题，同时手动拼图速度慢，不适合大批量，高通量样本处理，比如医院病理科日均上百病理切片观察，手动拼图方式无法满足要求。自动拼图的核心部件是全自动载物台，结合软件，可自动实现全自动，大范围全视野拍摄，结合自动Z轴对焦补偿，即可得到全视野的清晰图像。Echo Revolution 全自动荧光显微镜Echo Revolution全自动荧光显微镜，将XYZ三轴全部实现电动化，从而实现自动完成多图拼接的大视野高分辨率成像，而电动化的Z轴可以帮助用户实现自动聚焦、自动定焦和Z-Stacking 多层扫描大景深成像。Echo Revolution全自动荧光显微镜还添加了延时摄影功能，可以帮助用户实现长时间观察和时间回溯，使用户可以进行更全面的观察实验。