生姜中姜黄素检测方案

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时珍国医国药2011年第22卷第7期Shanghai Nano Industrial Co.，Ltd. LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011时珍国医国药2011年第22卷第7期纳诺仪器nano instrument 生姜中姜黄素的高效液相色谱-质谱法检测 刘春叶，张剑，尤青静，苗延青 (1.西安医学院·药学院，陕西西安710021：2.中国人民解放军西安第二炮兵工程学院，陕西西安710025) 摘要：目的建立一种测定生姜中姜黄素含量的简便、准确、抗干扰能力强的高效液相色谱法( HPLC)，同时用液相色谱-质谱联用法( HPLC-MS)确定其存在。方法用乙醇对生姜中姜黄素进行提取，用 HPLC 法测定含量。色谱条件： Kro-masil Cg柱(150mm×4.6 mm，5 pm)；流动相：乙腈：水(含8%冰醋酸)=49：51；流速为1.0 ml. min；检测波长430nm；柱温：室温。结果姜黄素线性范围为1020.00~40800.00 ng ml-(r= 0.999 5)，检测下限为785 ngml，日内精密度的 RSD 小于3%，加样回收率在96.00%~105.00%，RSD=3.35%。结论在1020.00~40800.00 ngml浓度范围内，峰面积积分值和浓度呈良好的线性关系。 HPLC - MS 法表明生姜提取液中存在姜黄素。方法学实验表明此方法具有操作简便、设备要求低、准确的特点，是一种生姜中姜黄素的比较完善的分析方法。 关键词：生姜； 姜黄素； 高效液相色谱-质谱法 DOI标识：doi：10.3969/j. issn. 1008-0805.2011.07.040 中图分类号：R284.2 文献标识码：B 文章编号：1008-0805(2011)07-1637-02 生姜( Ginger，Zingiber officinale Roscoe) 为姜黄属植物，是人们日常生活中必备的香辛调味料。生姜还是一味重要的中药材，“冬食萝卜夏吃姜，不用医生开药方”，自古以来中医学家和民间就有“生姜治百病”之说，中医视其为常用药材之一。我国卫生部将其首批公布为药食兼用植物资源之一。姜黄素( Curcumin)是生姜中主要有效成分，具有多种生物学活性，是生姜发挥药理作用的主要成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、降血脂等广泛的药理作用1，2。近年来随着姜黄素市场需求量的增大，姜黄素出现短缺，寻找新的姜黄素资源十分必要。生姜中含有姜黄素，但其检测报道却较少。 目前，对姜黄、莪术、郁金或一些成药中姜黄素进行检测的研究较多，主要的检测方法有高效液相色谱法( HPLC) B3，4、毛细管电泳法( CE)，光、荧光分光光度法”等。本研究旨在建立一种测定生姜中姜黄素含量的简便、准确、抗干扰能力强的HPLC 方法，并用 HPLC -MS 法对生姜中的姜黄素进行确认。 仪器与试剂 Dionex P680 型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；KromasilCi8柱(150mm×4.6 mm，5 pm)； LTQ -XL 质谱仪(Thermo，美国)； HPLC-MS(安捷伦，美国；“弘祥隆”DCTZ-2000 三频多用途恒温超声提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)；DEG -303A 艾柯超纯水机(成都康宁实验专用纯水设备厂)；标准检验筛(上虞市大亨化验仪器厂)；TGL-16G型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；0.45 u.m 的微孔滤膜。 乙腈、乙醇、甲醇(色谱纯，天津科密欧试剂公司)；姜黄素(对照品，天津一方科技有限公司)；所用水均为超纯水；生姜(市售)。 2 方法 2.1 色谱条件 Kromasil C1g柱(150 mm ×4.6 mm，5 pm)；流动相为乙乙：水(含8%冰醋酸)=49：51；流速为1.0 ml·min―-1.检测波长430 nm；柱温为室温；每次进样10 ul；色谱图见图1。 2.2 线性关系考察精密称取姜黄素对照品 0.0102 g，用适量甲 ( 收稿日期：2010-07-20； 修订日期：2011-01-27 ) ( 基金项目：西安医学院科学研究项目(No.2009FZ01) ) ( 作者简介：刘春叶(1977)，女(汉族)，陕西渭南人，现任西安医学院副教授，博士学位，主要从事生物分子的分离检测研究工作. ) 醇溶解并定容于100 ml 棕色容量瓶中，得浓度为1.02×10“g·ml的姜黄素标准储备液，于4℃冰箱中保存。精密量取各对照品标准使用液，制得一系列不同含量的对照品溶液，各取10pl依次进样。按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品含量(mgml-)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=584.38X-0.15，r=0.999 5，线性范围1020.00~40800.00 ng*ml-1 0.02.04.0 6.0 8.010.012.014.016.018.020.0t/min 图1 姜黄素对照品 HPLC 图 2.3 样品溶液的制备将生姜清洗干净，切片，于50℃烘箱中干燥后粉碎，过40目筛，在聚能式超声提取仪上用乙醇提取。提取条件：功率600W，固液比1：65，提取时间20 min，过滤，浓缩，得生姜提取液样品。此提取液离心(4500 r/min) 15 min，上清液过0.45 u.m滤膜后上样分析。 2.4 HPLC-MS联用 HPLC -MS 分析在 Aglient 液质联用仪上完成，HPLC 条件同“2.1”项； MS条件：毛细管电压35.46V，温度299.91℃，电喷雾温度-60.32℃，在m/z 50~600范围内扫描。 3 结果与讨论 3.1 萃取剂的选择姜黄素极性较小，可选择弱极性或非极性的溶剂将其溶出。实验发现，姜黄素不溶于水及乙醚，溶于乙醇、丙酮、乙二醇、冰醋酸及碱性溶液。由于乙醇毒性小、脂溶性较差，既能使姜黄素溶出，又不至于引入脂溶性杂质，故选择乙醇作为萃取剂，但乙醇的提取率低，故采用“2.3”项下聚能式超声提取法，提取率可显著提高。 3.2 检测波长的选择用甲醇作参比，测定姜黄素的紫外吸收光谱，发现其在420~450 nm 处有较大吸收，依次对 400，430，460nm 波长进行实验比较，结果发现波长430 nm 处干扰较小，峰型对称，基线平稳，因此最后选定测定波长在430 nm. 3.33柱温的选择在“2.1”色谱条件下，在25~50℃温度范围内 每隔5℃度测定一次姜黄素对照品溶液。结果发现，柱温对姜黄素色谱峰峰形及保留时间的影响均不大。考虑柱子寿命及方便操作，选择色谱柱温度为室温。 3.4 流动相的选择姜黄素是由两个邻甲氧基化的酚以及一个β-二酮组成，属于多酚类化合物，邻甲氧基苯酚的酸性由于邻位效应，酸性强于苯酚。低pH条件有利于抑制姜黄素上酚羟基的解离，减小样品的离子化程度，改善峰形。流动相中添加醋酸可以降低 pH 值，最后确定最佳流动相为乙腈：水(含醋酸8%)=49：51。姜黄素的保留时间约为9.7 min，理论塔板数为6 058/m，可见本方法柱效较高，可满足测定要求。 3.5 方法学考察将对照品溶液稀释不同倍数后进样，发现当姜黄素为7.85×10-gml时，信噪比(S/N)≥3，可确定为本方法的最低检测限。以浓度为5.10×10-gml-的姜黄素对照品溶液，按“2.1”项下方法进行检测，考察方法的精密度。实验结果显示，姜黄素连续进样6次，其峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.40%；在0，1，2，3，4，5，6h进样，结果显示，姜黄素峰面积的RSD值为1.00%。取已知含量的生姜超声提取液样品3份，精密加入浓度为1.02×10-4g·ml-'的姜黄素对照品溶液0.08，0.11，0.12 ml，用乙醇重新配置到标准曲线范围，按照“2.1”项下色谱方法分别进行3次试验，计算回收率。结果见表1。结果表明，3组样品，在加入不同量的姜黄素对照品的情况下，回收率在96.00%~105.00%之间，RSD 均值也小于5%。说明该方法的准确度高、重现性好，符合有关规定要求。 3.6 专属性试验取未检测到姜黄素素生姜提取液样品，离心，上清液过 0.45 p.m 滤膜，进样10 pl。结果见图2(a)。其中未检测到姜黄素；将高、低两个浓度的姜黄素对照品溶液加入样品中，同法操作。色谱图见图2(b)2(c)。结果表明，生姜提取液中杂质不干扰测定，本色谱方法具有较高的专属性。 3.7 应用以“2.3”项下超声方法制备的生姜提取液样品，离心，上清液过0.45 u.m 滤膜，进样10 pl。结果见图3。可见姜黄素在此条件下达到基线分离。通过标准曲线计算生姜中姜黄素的含量为1.13 mg/100 g。鉴于我国民间经常用生姜来炝锅，即在沸油中煸炒，故本研究还对在沸油中煸炒后的生姜同样采用“2.3”项下方法进行提取，提取液样品，离心，上清液过0.45 p.m滤膜，进样10pl，结果表明，此时姜黄素含量降低为 0.68 mg/100 g。可见，本方法可以有效地检测出生姜及炝锅后生姜中姜黄素的含量。 表1 姜黄素回收率实验结果 RSD 样品含量加入对照品 峰面积 回收率 平均回收率 (%) m/ng 量m/ng (%) (%) 10810 8160 7.397 105.00 10810 8160 7.270 101.00 10810 8160 7.186 98.37 10810 11220 8.409 96.48 10810 11220 8.639 96.00 99.73 3.35 10810 11 220 8.415 96.86 10810 12240 8.661 99.49 10810 12 240 8.638 104.75 10 810 12240 8.679 99.63 a-生姜提取液的色谱图 b-加1.02×10-5gml-姜黄素对照品溶液c-加0.51×10-g们ml-姜黄素对照品 图2 生姜提取液及对照品色谱图 图3 生姜提取液的 HPLC 图 图4为生姜提取液的 HPLC -MS谱图。姜黄素分子易分解为分子量为192的分子和m/z为177的正离子片段。图4中m/z为465 的离子峰为姜黄素二聚体与分子量为192分子片段结合后加2个质子所形成的母离子峰。此结果从另一方面证明了生姜提取液中含有姜黄素c 图4 生姜提取液的 HPLC -MS 图 4 结论 本研究采用生姜提取液作为样本，探索并建立了生姜中姜黄素含量测定的 HPLC 方法：流动相为乙腈：水(含8%冰醋酸)=49：51；流速为1.0 ml· minn-；检测波长为430 nm；柱温室温。该方法具有快速，准确，重复性好的优点。在1020.00~40800.00 ngml浓度范围内，峰面积与姜黄素浓度呈良好的线性关系，最低定量限1020.00 ng ml，理论塔板数理6058/m. 方法精密度考察结果显示，该方法的日内精密度为1.00%。 这些方法学指标均符合中国药典委员会在2010年颁布的《中国药典》中对姜黄素分析以及对高效液相色谱方法学的要求。同时，采用 HPLC -MS 方法对生姜提取液中姜黄素存在进行确认。 以上实验结果表明该方法是生姜中姜黄素检测的有效方法，可用于生姜中姜黄素含量的测定和确认以及姜黄素的相关研究。 ( 参考文献： ) ( [1] 毕新岭，顾 军，米庆胜.姜黄素防治皮肤癌的研究进展.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2003，2(2)：130. ) ( [2] Bharti AC， Dormto N ， Singh S， et a 1. C urcumin ( diferuloylmethane) down -regulates t h e c o nstitutive activation o f nuclear factor - K B a n d IKB k inase in h uman multiple m y eloma cells，leading to suppression of proliferatio n and inductio n of apoptosi s [. Blood，2003，101：1053. ) ( [3] Jadhav B K，Mahadik KR ， Paradkar AR. Development and v alidation ofimproved reversed p hase - H P LC method for simultaneous determinationof curcumin， demethoxycurcumin and b is - demethoxycurcumin [ J].Chromatographia，2007，6 5 (7/8)： 4 83. ) ( [4] 杨 敏，潘洪林，许汉林.反相高效液相色谱法测定肝脂平胶囊中姜黄素的含量[.时珍国医国药，2006，17(6)：970. ) ( [5] 黄宝美，莫金垣.毛细管电泳安培法测定脂可平胶囊中的姜黄素.分析试析室，2006，25(7)：1. ) ( [6] 薛 玲，林秀丽，张惠云，等.郁金中姜黄素类化合物的毛细管区带电泳法测定叨.化学研究与应用，2006，18(4)：368. ) ( [7] 严建伟，鲍慰文，梁炳析，等.荧光分光光度法测定姜黄制剂中的姜黄素[.中国现代应用医学杂志，1998，15(2)：44. ) 贞芪扶正胶囊联合阿德福韦对 CHB 细胞免疫功能及抗病毒疗效的意义 华 忠，薛博瑜?*，金小晶，黄利华，顾锡炳，李燚光，杨小娟'(1.江苏省无锡市传染病医院·无锡市肝病研究所214005： 2.南京中医药大学，江苏南京210029： 3.江苏省南京市中医医院 220007) 摘要：目的评价贞芪扶正胶囊联合阿德福韦与单用阿德福韦为对照治疗慢性乙型肝炎( CHB) 对患者外周血淋巴细胞免疫功能及抑制乙肝病毒复制的影响。方法将70例慢性乙型肝炎患者在保肝治疗基础上，随机分为治疗组35例，对照组35例，治疗组服用贞芪扶正胶囊及阿德福韦，对照组为单用阿德福韦。给药方法为：治疗组口服阿德福韦 10 mg，1 次/d，同时服贞芪扶正胶囊，1.4 g/次，2次/d，口服；对照组：口服阿德福韦 10 mg，1 次/d。疗程均为24周。结果外周血淋巴细胞免疫功能指标：治疗24周时， CD4*、CD4*/CD；*、NK 数值，治疗组较对照组，差异有显著性(P<0.05)。血清e抗原阴转率应答：治疗24周时，治疗组较对照组差异有显著性(P<0.05)。HBV DNA 载量应答：治疗12周时，治疗组较对照组差异无显著性(P>0.05)；治疗24周时，治疗组较对照组，差异有显著性(P<0.05)。结论贞芪扶正胶囊联合阿德福韦治疗 CHB，在调节细胞免疫功能方面优于单用阿德福韦，同时在降低 HBVDNA载量及血清e抗原阴转率方面优于单用阿德福韦。 关键词：慢性乙型肝炎； 贞芪扶正胶囊； 阿德福韦； 细胞免疫功能； 抗病毒 DOI标识：doi：10.3969/j. issn. 1008-0805.2011.07.041 中图分类号：R259 文献标识码：B 文章编号：1008-0805(2011)07-1639-02 现代医学研究认为慢性乙型肝炎与细胞免疫功能的改变有关，中医药能提高细胞免疫功能"。为此，我们采用贞芪扶正胶囊联合阿德福韦治疗 CHB，观察中药联合阿德福韦对患者细胞免疫功能及抗病毒疗效的影响。现将结果报告道下。 研究对象 选择从2008-01~2010-01在本院门诊和住院的诊断均符合2000年全国病毒性肝炎学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中慢性乙型肝炎诊断标准70例患者，随机分为两组：对照组35例，男25例，女10例，平均年龄(42.2±14.5)岁；治疗组35例，男26例，女9例，平均年龄(41.5±15.1)岁。按肝功能损害程度区分，治疗组患者轻度28例，中度7例，其中 HBeAg 阳性CHB20例；对照组患者轻度26例，中度9例，其中 HBeAg阳性 ( 收稿日期：2010-09-21； 修订日期：2010-12-08 ) ( 基金项目：江苏省无锡市科技局中医类指令性专项研究(No.ZXM0804) ) ( 作者简介：华 忠(1972-)，男(汉族)，江苏无锡人，现任江苏省无锡市传染病医院、无锡市肝病研究所主治医师，硕士学位，主要从事慢性肝炎、肝硬化的中西医治疗研究工作. ) ( 通讯作者简介：薛博瑜(1957)，男(汉族)，江苏常州人，现任南京中医药大学教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事中医药防治慢性肝病 ) CHB19例。两组临床症状有乏力、食欲不振、腹胀、睡眠欠佳、肝区不适、大便性状改变等；体征有黄疸及肝脾肿大。两组患者治疗前在性别、年龄、病程、肝功能损害程度及临床表现及体征等方面比较，差异无显著性意义(P>0.05)，具有可比性。 2 治疗方法 2.1 分组及给药慢性中度乙型肝炎均使用2周基础治疗，用甘利欣注射液(江苏正大天晴制药有限公司生产)30 ml加入10%葡萄糖注射液中静脉滴注，qd，口服西利宾胺片(江苏中兴制药有限公司提供)，0.2 g tid。有黄疸者，用苦黄注射液(江苏常熟雷允上制药有限公司生产)30 ml 加入10%葡萄糖注射液中静脉滴注，qd。对照组在基础治疗上加用口服阿德福韦(江苏正大天晴制药有限公司生产)10 mg，qd；治疗组在对照组基础上，加用贞芪扶正胶囊(贵州信邦制药有限公司生产)口服，1.4 g，tid。两组疗程均为24周，所有病例在治疗过程中不可加用免疫调节剂，如黄芪口服液、干扰素、胸腺肽等。 2.2 检测方法 2.2.1 肝功能用日本日立公司生产 HITACHI7600-020 型全自动生化分析仪检测。 2.2.2 HBVM 和 HBV DNA HBVM 用1235 时间分辨荧光法，上海新波试剂检测，HBV DNA用PCR法，上海科华试剂检测。 ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. 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