栀子中熊果酸检测方案

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苏州市莱顿莱学仪器有限公司 www.laidun17.com www.sepu17.cnTEL： 0512-66325740 高效液相色谱法-测定乐山栀子熊果酸含量 摘要：熊果酸高含量为有光泽的棱柱状(无水乙醇)或细毛样针状结晶(稀乙醇)，低含量为棕黄色或黄绿色粉末，具特殊的气味，是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物。 目的为控制乐山栀子的质量，建立高效液相色谱法测定乐山栀子中熊果酸含量的方法。 方法采用高效液相色谱法，以熊果酸为化学对照品，固定相：UltimateTM C18键合硅胶柱(4.6mm×250mm，5um)，流动相：甲醇：水：冰醋酸：三乙胺(90：10：0.03：0.06)，流速0.6ml·min-1，温度25℃，波长210nm测定乐山栀子熊果酸含量。 结果熊果酸在0.1~3.0ug范围内峰面积A与其质量M呈现良好的线性关系，其回归方程为：A=-12954.8829+452850.9603M，r=0.9996，n=7；3批乐山栀子中熊果酸的含量分别为(0.2555±0.0016)mgg-1药材， RSD=0.6221%，n=4；(0.265825±0.003491)mgg-1药材， RSD=1.313%， n=4；(0.258875±0.006198)mg ·g-1 药材， RSD=2.394%， n=4；精密度实验RSD=1.754%，仪器精密度良好；稳定性实验 RSD=3.493%，在3.5h测定熊果酸的含量是稳定的；重现性实验 RSD=0.9051%，平均回收率101.9%。结论高效液相色谱法适合乐山栀子中熊果酸的含量测定，该方法操作简便，结果稳定，精密度、重现性、回收率较好，值得推广。 栀子为茜草科植物栀子 GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果实，主产于浙江、四川、江西、重庆、湖北等省。栀子具有泻火除烦、清热、凉血解毒之功效，用于热病心烦、黄疸、尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮痈等证。根据现代药理研究证实，熊果酸为栀子重要有效成分，具有显著而迅速降低谷丙转氨酶，消退黄疸，增进食欲和恢复肝功能的作用，这在茵栀黄注射液、茵陈蒿汤等方剂中得到广泛的应用。栀子治疗急性黄疸型肝炎、病毒性肝炎主要是通过其有效成分熊果酸实现的，熊果酸是栀子利胆退黄、抗病毒性肝炎的主要有效成分。栀子熊果酸还具有解热降温、抗炎、抗肿瘤等活性。有报道表明，栀子苷的生理活性有限，其利胆作用、保护肝损伤、降低转氨酶方面均不及栀子中熊果酸明显，而且栀子苷分子中双键性质活泼，不稳定，易发生反应。相比而言，栀子熊果酸受热更稳定，因此控制栀子熊果酸含量具有非常重要的质量评价意义[1~6]。本研究通过高效液相色谱法测定乐山栀子熊果酸含量，为建立乐山栀子质量新标准提供参考。 1、仪器与材料 SSI 高效液相色谱仪； UltimateTM C18键合硅胶柱(4.6mm×250mm， 5pm)； AS3120AUltrasonicCleaner； AP-01P真空泵； HaierBCD-176DA电冰箱； SHHV21型长风三用电热恒温水浴箱；ZK072 型电热真空干燥箱； RE-52B 型旋转蒸发器； AS701KDTUltrasonicCleaner； UV-9200 型紫外可见光分光光度计； FA1104W 电子天平； Sh10A 型水份快速测定仪；50目分样筛； KodakEasyshareZ7590 数位相机；CASIOfx-4800p 电子计算器；冰醋酸、甲醇三乙胺为分析纯，色谱纯甲醇；熊果酸化学对照品(110742-200516，约20mg， 供含量测定用) (中国药品生物制品检定所)、栀子产自四川乐山(经课题组鉴定为茜草科植物栀子 GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实)。 2、方法与结果2.1色谱条件固定相： UltimateTMC18键合硅胶柱(4.6mm×250mm， 5um)；流动相为甲醇：水：冰醋酸：三乙胺(90：10：0.03：0.06)；流速0.6ml·min-1；温度25℃；波长210nm[7]. 2.2栀子熊果酸提取条件优选以药材粒径、甲醇加入量、超声提取时间、超声提取次数4因素3水平，以熊果酸收率为指标，选用L9(34)正交表优选栀子熊果酸提取条件为：栀子药材粉碎为50目粉末，加入甲醇量为药材量的5倍，每次超声提取 60min， 超声提取3次，，可使熊果酸收得率达到最大，且经济合理，将另文报道。 2.3熊果酸标准曲线绘制[8]精密称取熊果酸化学对照品2.0mg(60℃减压干燥24h)，用无水甲醇定容于10ml容量瓶中，即得0.2mg· ml-1 的熊果酸对照品溶液。熊果酸在0.1~3.0mg范围内峰面积A与其质量M呈现良好的线性关系，其回归方程为： A=-12954.8829+452850.9603M， r=0.9996， n=7。 2.4精密度实验精密吸取上述熊果酸对照品溶液10u1， 其积分面积 RSD=1.754%， n=5， 表明该方法、该仪器测定熊果酸精密度符合要求。 2.5稳定性实验精密吸取上述熊果酸对照品溶液10ul，每隔30min测定1次，其积分面积RSD=3.493%，n=5。表明熊果酸用该方法在该仪器上3.5h内测定结果较稳定，符合要求。 2.6栀子熊果酸含量测定重现性实验照前面“2.2”项栀子熊果酸的提取工艺，测得栀子熊果酸含量 RSD=0.9051%，表明该方法重现性实验符合要求。 2.7栀子熊果酸加样回收率实验照前面“2.2”项栀子熊果酸的提取工艺提取，取该溶液2ml，加入上述熊果酸对照品溶液0.3ml，平均加样回收率为101.9%，表明该方法测定栀子熊果酸的加样回收率符合要求。 2.83批乐山栀子熊果酸含量测定按照“2.2”项的提取条件提取3批乐山栀子熊果酸，按照上述测定条件分别测定熊果酸含量，测定结果见表1[9]。 3讨论经过采集乐山、云南、贵州、湖南、河南等地的栀子并测定熊果酸含量，发现乐山栀子含量最高，证实其确为质量优良的正宗川栀子。 实验发现，上述熊果酸对照品溶液积分面积为1.5×105~2.5×105，峰高为6×103~7×103，理论塔板数约1.2×104时，峰高法计算结果与真实值的误差为1.240%，积分面积计算结果与真实值的误差为1.415%，表明峰高法比积分面积法更接近真实值，尤其适用于熊果酸峰与齐墩果酸及其衍生物峰未完全分开时。考虑到乐山栀子中熊果酸峰与齐墩果酸及其衍生物峰完全分开，而且峰高法计算结果与峰面积法计算结果无显著性差异，出于习惯考虑，本文仍采用峰面积法测定乐山栀子熊果酸的含量。表1乐山栀子熊熊酸含量(略) 冰醋酸主要用于改善熊果酸与齐墩果酸及其衍生物图谱分离度，由于冰醋酸具有挥发性，对熊果酸与齐墩果酸及其衍生物图谱分离度存在一定程度的波动，通过反复实验，才得到较成功的图谱。若改用不具有挥发性的磷酸，则能改善熊果酸与齐墩果酸及其衍生物图谱分离度的波动性，可能更容易成功，有待于进一步研究。 熊果酸提取温度最好在60℃以下，样品溶液置于0℃冰箱中贮存，测定时分析室的温度控制在25℃左右，以避免熊果酸分解对结果造成影响。 第页 共页