可乐中4-甲基咪唑（4-MT）检测方案(气质联用仪)

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SSL-CA09-843Excellence in Science Excellence in ScienceGCMSMS-040 GC-MS/MS 法测定可乐中4-甲基咪唑含量 GCMSMS-040 摘要：本文采用岛津三重四极杆气相色谱质谱联用仪 GCMS-TQ8030 对可乐中4-甲基咪唑进行测定。标准溶液浓度在5~1000 ug/L范围内，标准曲线线性良好， r=0.9998，组分的检出限为1.11 ug/L，平均加标回收率为81.75%，浓度为5 ug/L 标样连进进样5针峰面积 RSD 为4.15%，该方法操作简便快捷，测定准确。 关键词： GC-MS/MS可乐4-甲基咪唑 4-甲基咪唑(4-Methylimidazole)，白色或类白色的结晶粉末，是一种重要的有机中间体。研究表明，4-甲基咪唑能够提高小鼠肿瘤和白血病的发病率，由此推测，其可能会对人体产生一定的致癌性。 可乐饮料中的4-甲基咪唑主要来源于焦糖色素。焦糖色素是一种食用色素，广泛应用于可乐、酱油、食醋、黄酒、啤酒等饮料和食品中。直接用糖煮制的焦糖色素不含有4-甲基咪唑，而当前国内外大部分厂家生产的焦糖色素都是使用“氨类化合物”作为催化剂，或是由 实验部分 1.1仪器 三重四极杆气质联用仪：GCMS-TQ8030 1.2分析条件 色谱柱： InertCap WAX，30 mx0.25 mmx0.25 um 柱温程序：80℃(1 min)_20℃/min_150℃_ 5℃ /min_250℃(2 min) CID气：氩气 进样口温度：250℃ 进样量：1uL 进样方式：不分流，1 min 载气控制方式：恒线速度方式 样品前处理 2.1色谱图 糖、氨水及亚硝酸盐在高温高压下反应而成，这种工艺中会生成4-甲基咪唑。世界卫生组织对焦糖色素中4-甲基咪唑的限量为200 mg/kg， 我国国家标准 GB8817-2001对氨法生产的焦糖色素中4-甲基咪唑的含量规定不超过 0.02%。 本文使用三重四极杆气相色谱质谱联用仪建立了可乐中4-甲基咪唑的检测方法，该方法操作简单，准确可靠，检出限低，适用于可乐饮料中4-甲基咪唑含量的测定。 载气线速度：36.8cm/sec 接口温度：250℃ 离子源温度：230℃ 采集方式： MRM 1.3样品制备 将样品在室温放置30 min， 去碳酸气，量取5mL样品移入250 mL 分液漏斗中，以10 mol/L 的氢氧化钠溶液将样品pH值调节为11，，加二氯甲烷萃取液40mL，充分震荡5 min， 静止分层后，收集下层有机相，用相同方法重复萃取3次，合并有机相，浓缩近干，用丙酮定容为2mL，待测。 图14-甲基咪唑标准溶液MRM图(0.5ug/mL) 表1 4-甲基咪唑的保留时间及MRM参数 No. 化合物名称 CAS# 保留时间(min) 定量离子对 CE 定性离子对CE 1 4-甲基咪唑 (4-Methylimidazole) 131-11-3 10.625 82>54 10 81>54 10 2.2标准曲线 配制6个级别的4-甲基咪唑标准溶液，浓度分别为：5、50、100、200、500、1000 ug/L，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，4-甲基咪唑标准曲线如下所示。 图24-甲基咪唑标准曲线 2.3检出限及重复性 根据5 ug/L 标准溶液数据，计算方法检出限(3倍信噪比计算)，4-甲基咪唑检出限见表2。浓度为 5 ug/L的标准溶液连续进样5针，计算峰面积RSD%考察仪器重复性，结果如表2所示。 表24-甲基咪唑标准曲线相关系数、检出限及峰面积重复性(n=5) No. 组分名称 相关 检出限 RSD% 系数 (ug/L) 1 4-甲基咪唑 0.9998 1.11 4.15 2.4回收率 选取市售某种可乐分别进行测定和回收率实验，样品加标浓度为200 ug/L， 按照样品前处理方法平行处理3份，进样分析，可乐样品测定结果和加标回收率见表3. 图3样品MRM谱图 表3样品检测结果及加标回收率 No. 组分名称 可乐样品 加标样品 检测结果(ug/L) 回收率% 平均回收率% RSD%(n=3) 75.02 1 4-甲基咪唑 112.40 85.90 81.75 7.20 84.34 结论 采用岛津 GCMS-TQ8030 对可乐饮料中4-甲基咪唑进行分析测定，该方法操作简单，在标准样品浓度在5~1000 ug/L范围内，标准曲线线性相关系数为0.9998，组分的检出限为 1.11 ug/L，平均加标回收率为81.75%，此方法适用于可乐中4-甲基咪唑的检测要求。 岛津全球应用技术开发支持中心 LC-30A 测定焦糖色素及饮料中的4-甲基咪和2-甲基咪唑 LC-145 摘要：本文建立了一种使用超高效液相色谱仪 LC-30A，结合HILIC 色谱柱，无需使用离子对试剂快速测定焦糖色素和饮料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的方法。实验结果表明：在0.2~50mg/L 浓度范围内线性良好，相关系数大于0.9999；4-甲基咪唑和2-甲基咪唑仪器检出限分别为0.021 mg/L、0.023mg/L，定量限分别为 0.076 mg/L、0.069 mg/L。三个浓度标样6次连续进样的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在 0.02~0.08%和 0.18~1.46%之间，仪器精密度良好；焦糖色素样品和可乐饮料样品加标回收率在83.0%~91.6%之间。 关键词：4-甲基咪唑2-甲基咪唑超高效液相色谱焦糖色素饮料 焦糖色素是一种允许使用的半天然食品着色剂，广泛应用于饮料、酱油、食醋、甜品等生产中。在亚硫酸铵法或氨法生产焦糖色素的过程中，会产生有毒副产物4-甲基咪唑和2-甲基咪唑，具有可能的致癌作用。故我国的国家标准规定以亚硫酸铵法或氨法生产的焦糖色素中4-甲基咪唑的含量应不大于 0.02%，但未限定2-甲基咪唑的含量。 目前，我国国家标准中已有焦糖色素中4-甲基咪唑的检测方法，采用薄层色谱法和离子对色谱法进行测定。尚没有食品中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的分析方法。薄层色谱法准确度较差，离子对色谱法平衡时间长，分析周期长，且对色谱柱有一定的损耗。 本文采用岛津超高效液相色谱仪LC-30A结合HILIC色谱柱，测定了焦糖色素和可乐饮料中的4-甲基咪唑和2-甲基咪唑，供相关检测人员参考。 1.实验条件 1.1仪器和材料 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A二二元高压梯度系统。具体配置为：LC-30AD输液泵，DGU-20A5R在乡脱气机，SIL-30AC 自动进样器， CTO-30A 柱温箱， RF-20AXS荧光检测器， CBM-20Alite 系统控制器， LabSolutions 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Xbridge HILIC， 2.1 mmI.D.x100mmL.，2.5 um 流动相：A：5mM甲酸铵水溶液；B：乙腈流速：0.45mL/min 进样体积：5pL 柱温：335℃ 检测波长：215nm 洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度 B%=90%： 表1梯度时间程序 Time Module Action Value 3.00 Pumps Pump B Conc. 80 4.00 Pumps Pump B Conc. 80 4.10 Pumps Pump B Conc. 90 8.50 Controller Stop 1.3样品制备 1.3.1标准溶液配制 以乙腈/甲醇(9/1，v/v)配制浓度为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L等8个标准溶液浓度系列。 1.3.2样品前处理方法 称取3g焦糖色素，用水稀释，并定容至15mL。或称取3g饮料，超声5 min 后待净化。取 MCX 固相萃取小柱(60 mg/3mL)，依次用3mL甲醇和3mL水活化，取饮料超声后样品或3mL焦糖色素稀释样品以1 mL/min 流速过柱，依次用3mL 2%甲酸水溶液和3mL甲醇淋洗，抽干，用3mL5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，40℃氮气挥干，乙腈/甲醇(9/1，v/v)定容至1mL，0.22 um滤膜过滤后待测。 2. 2.1标准样品的色谱图 标准样品色谱图如图1所示。 图1标准样品色谱图(5mg/L) 2.2线性关系 将8个不同浓度的黄曲霉毒素标准工作溶液，按1.2中的分析条件进行测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，结果如图2、图3所示。 图24-甲基咪唑的标准工作曲线 图32-甲基咪唑的标准工作曲线 2.3检出限和定量限 根据标准曲线中的最低点0.2 mg/L计算仪器的灵敏度，通过 LabSolutions 软件，按照 ASTM方式， 选取基线为3.2-3.7min 计算信噪比，4-甲基咪唑和2-甲基咪唑仪器检测限(3倍噪声计算)分别为0.021mg/L、0.023mg/L；定量限(10倍噪声计算)分别为 0.076 mg/L、0.069 mg/L。 0.2mg/L标样色谱图如图4所示。 图40.2mg/L标准溶液的色谱图 2.4精密度实验 中、高三个不同浓度标准溶液，分别平行进样6次，目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02~0.08%和0.18~1.46%之间，仪器精密度良好。 表2保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 组分 浓度 R.T.(RSD%) Area (RSD%) 4-甲基 0.5 0.038 1.403 2.0 0.036 0.274 咪唑 10 0.080 0.176 2-甲基 0.5 0.037 1.459 2.0 0.025 0.766 咪唑 10 0.053 0.282 2.5加标回收实验 按照1.3.2所述方法处理焦糖色素样品、市售可乐饮料样品和加标样品，上机测试。色谱图如图5、图6、图7、图8所示。加标回收结果见表3. 图5焦糖色素样品色谱图 图6焦糖色素加标样品色谱图(加标量：5.0mg/kg) 图7可乐饮料样品色谱图 图8可乐样品加标标谱图(加标量：5.0mg/kg) 表3加标回收结果 基质 化合物名称 样品 加标量 实测值 回收率 mg/kg mg/kg mg/kg 焦糖 4-甲基咪唑 N.D. 4.15 83.0% 色素 2-甲基咪唑 5.0 4.34 86.8% 可乐 4-甲基咪唑 N.D. 5.0 4.58 91.6% 饮料 2-甲基咪唑 4.55 91.0% 注： N.D.表示未检出 3结论 本文建立了一种使用超高效液相色谱仪LC-30A，结合 HILIC色谱柱，无需使用离子对试剂快速测定焦糖色素和饮料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的方法。实验结果表明：]：两种化合物在 0.2 mg/L~ 50 mg/L 浓度范围内线性良好，相关系数大于 0.9999；4-甲基咪唑和2-甲基咪唑仪器检出限分别为0.021 mg/L、0.023mg/L，定量限分别为 0.076mg/L、0.069 mg/L。三个浓度标样6次连续进样的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.02~0.08%和0.18~1.46%之间，仪器精密度良好；焦糖色素样品和可乐饮料样品加标回收率在83.0%~91.6%之间。本方法适合作为焦糖色素及饮料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的快速分析方法。 附录： 表4化合物信息表 中文名称 英文名称 CAS号 4-甲基咪唑 4-Methylimidazole 822-36-6 2-甲基咪唑 2-Methylimidazole 693-98-1 咨询电话：海市淮海西路红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn 岛津全球应用技术开发支持中心http：//www.shimadzu.com.cn上海市淮海西路红坊E楼 咨询电话：    近期，“酱油”、“致癌物”、“焦糖色”、“4-甲基咪唑”成了热搜，有媒体报道称，国内“某天”等11款酱油检出微量致癌物4-甲基咪唑，且老抽中的含量明显高于生抽，有的甚至高达6mg/kg。其实，躺枪的还有一位，那就是彰显着青春、活力、时尚的“可乐”。酱油和可乐都拥有深沉而神秘的红褐色容颜，有研究表明，红色指数高的焦糖色有显著的诱食作用，尤其对于我们这些“颜控”。    今天，小编就带你揭开这“红褐色容颜”的神秘面纱，聊聊酱油和可乐的“颜值担当”--焦糖色。    焦糖色通常是深褐色的粉末或者粘稠液体，带有特殊的焦香和苦味。目前食用焦糖色主要有三种生产方法：普通法、氨法和亚硫酸铵法。其中用于酱油的主要是前两种，第三种则用于酸性饮料，比如可乐。使用氨法和亚硫酸铵法生产工艺会产生两种致癌副产物：4-甲基咪唑（4-MT）和2-甲基咪唑（2-MT）。研究发现，4-MT会在雌雄小鼠中导致肺癌，2-MT会在雌雄小鼠中导致肝癌。   世界卫生组织对焦糖色素中4-甲基咪唑的限量为200mg/kg，国标《GB1886.64-2015 食品安全国家标准食品添加剂焦糖色》对氨法和亚硫酸铵法制成的焦糖色中4-甲基咪唑的含量规定不超过200mg/kg，对2-甲基咪唑的含量未限定。   岛津高端分析仪器可检测出“酱油”和“可乐”中痕量“4-甲基咪唑”和“2-甲基咪唑”。   有图有真相，请先看看我们用岛津旗舰级三重四极杆型气相色谱质谱联用仪GCMS-TQ8050的实验结果。    岛津串级质谱GCMS-TQ8050搭载全新大容量超高效真空系统，配合三重降噪技术，具备目前同类产品中最快扫描速度（20,000 u/sec），特有的UFsweeper碰撞池，实现最快MRM速度（888MRM/sec）和最小驻留时间（0.5ms），可提供“阿克级”定量分析。岛津三重四极杆气相色谱质谱联用仪GCMS-TQ8050   对于使用串级质谱的实验猿来说，摸索新化合物的最佳MRM条件是不是最头疼？现在，通过特色的“MRM自动优化工具”可以自动收集产物离子扫描数据，自动寻找最优离子通道和碰撞能信息。 再来看看我们用岛津超高效液相色谱仪LC-30A的实验结果。                       岛津超高效液相色谱仪Nexera UHPLC是一个全能的LC系统，利用革命性的技术提供高效超高速LC分析。     本实验使用UHPLC LC-30A二元高压梯度系统。具体配置为：LC-30AD输液泵， SIL-30AC自动进样器，CTO-30A柱温箱，RF-20AXS荧光检测器，LabSolutions色谱工作站。   岛津Nexera LC-30AD输液泵具有卓越的输液性能，可在0.0001~5.000ml/min内进行准确输液。在0～3mL/min的流速范围内实现世界最高130Mpa的高耐压，在高流量区域也维持了高耐压，完美应对各种分析。    RF-20Axs荧光检测器具有世界最高水平的灵敏度：水拉曼峰S/N 比2000 以上的超高灵敏度。作为世界上唯一配备带冷却功能的温控检测池，带来出色的重现性。   最新设计的色谱工作站Labsolution，界面友好，并有丰富的向导文件，提供了完备的原始数据和方法的安全保障，具有完备的数据审计追踪能力，更易于方法的确认，并标准配置了系统适应性软件。