血清中苯巴比妥浓度检测方案(二手分析仪器)

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万方数据WANFANG DATA文献链接 高效液相色谱外标法快速测定苯巴比妥血药浓度 刘光斌*，姜芳宁，高 颖(甘肃省酒钢医院药学部，甘肃嘉峪关735100) 中图分类号 文献标志码 B 文章编号 1672-2124(2012)09-0811-03 摘 要 目的：建立高效液相色谱(HPLC)外标法快速测定人血清中苯巴比妥的浓度。方法：血清样品经甲醇沉淀后，以甲醇-水(40：60，V：V)为流动相，流速为1.0mL·min，色谱柱为 Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 pm)，柱温为30℃，紫外检测波长为 214 nm。结果：血清内源性杂质不干扰待测物的测定，苯巴比妥的线性范围为4.5~72.8 pg*mL-，日内、内间精密度(RSD)均<5% ，样品稳定性良好。结论：该法灵敏、快速、准确、操作简便、线性范围宽，可用于苯巴比妥的血药浓度监测。 关键词 苯巴比妥；高效液相色谱法；外标法；血药浓度 Determination of Phenobarbital in Human Serum by HPLC External Standard Method LIU Guang-bin*， JIANG Fang-ning， GAO Ying (Dept. of Pharmacy， Gansu Jiugang Hospital， GansuJiayuguan 735100，China) ABSTRACT OBJECTIVE：To establish a HPLC external standard method for rapid determination of Phenobarbital inhuman serum. METHODS： Serum samples were precipitated by methanol followed by separation on the column ofInertsil ODS-SP (150 mm×4.6 mm，5um) at 30 ℃. The mobile phase consisted of methanol-water (40：60，V：V) ata flow rate of 1.0 mL·min. The detecting wavelength was set at 214 nm. RESULTS： The intrinsic impurity of plasmadid not interfere with the determination of analyte. The linear range of arbamazepine was 4. 5-72.8 pgmL.The inter- 表1 分煎汤剂栀子苷加样回收测定结果 Tab 1 Results of recovery test of geniposide in separateddecoction sample 序样品取样量样品含量； 加人量 实验量 回收率/平均回 RSD/ 号 (mg/m) (mg/m) (mg/m) (mg/m) % 收率/% % 1 4.581 1.314 1.250 2.571 100.56 100.83 0.50 2 4.621 1.325 1.250 2.584 100.72 3 4.593 1.317 1.250 2.571 100.32 4 4.525 1.298 1.250 2.553 100.40 5 4.586 1.315 1.250 2.592 102.16 表2 合煎汤剂栀子苷加样回收率测定结果 Tab 2 Results of recovery test of geniposide in mixeddecoction sample 序样品取样量样品含量加入量 实测量回收率/平均回收 RSD/ 号 (mg/m) (mg/m) (mg/m) (mg) % 率/% % 4.361 1.115 1.250 2.322 96.56 96.58 0.41 2 4.235 1.082 1.250 2.307 98.00 3 4.215 1.077 1.250 2.280 96.24 4 4. 243 1.084 1.250 2.290 96.48 5 4.235 1.083 1.250 2.278 95.60 ( *副主任药师。研究方向：临床药学、医院制剂研发。E-mail： jgyylgb@ sina. com ) 2.8 样品含量测定 各制备5份，测定栀子苷含量，求平均含量。合煎液平均含量为 114.98 mg，分煎液平均含量为130.41 mg。结果显示，连朴饮分煎液比合煎液中子苷的含量高。 3 讨论 本研究采用 IIPLC 法测定中药复方制剂中的栀子苷含量，文献报道可用多种不同组成的流动相系统2.41，本实验选择《中华是否是一个比较普遍现象，还有待广泛的研究才能确定。本实验测定连朴饮中有效成分栀子昔在分煎、合煎过程中含量有无变化，为连朴饮配方颗粒应用于临床提供一些理论依据。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S] 2010年版、北京：中国医药科技出版社，2010：231-232. ) ( [ 2 ] 吴红娟，王清波，谭朝阳，等.不同来源栀子中栀子苷 含量测定[J].湖南中医药大学学报，2010，30(5)：35- ) ( [3] 段 启，庄义修，陈华师. 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KEY WORDS Phenobarbital； HPLC； External standard method； Serum concentration 苯巴比妥(phenobarbital，PBB)是一种广谱抗癫痫药，常用于儿童抗癫痫治疗，该药治疗窗狭窄、药动学和药效学的个体差异大，其血药浓度与疗效及不良反应有密切关系，仅依靠临床观察，短期内难以判断疗效或毒性。因此，进行血药浓度监测对个体化用药有重要的临床意义。PBB血药浓度的测定方法有荧光偏振免疫分析法(FPIA)、酶联免疫法(EMIT)()、紫外分光光度法(UV)、高效液相色谱法(HPLC) [2.4]等。上述方法各有优缺点，如FPIA 法和 EMIT法具有高度自动化、取血量小、操作简便、快速、准确、灵敏度高的优点，但试剂盒昂贵，测试费用较高；UV 法优点是操作简单、费用低廉，但其灵敏度低、专一性差，容易受到血液中其他成分的干扰；而 HPLC法具有分离度好、灵敏度高、专属性强、成本较低等优点，但存在样品前处理复杂、技术性较强的缺点。文献报道的 HPLC测定PBB 的方法大多采用内标法，鲜有外标法的报道。笔者采用HPLC外标法并直接用甲醇沉淀血清中蛋白的方法测定血清中 PBB 浓度，样品前处理不需要萃取、复溶等复杂操作，方法简单、快速、准确，现报道如下。 1 仪器与试药 日本岛津LC-2010AHT 型高效液相色谱仪(配备四元高压泵，在线真空脱气机，自动进样器及其温控系统)；岛津 LCsolution 工作站；超纯水仪(杭州天创净水设备有限公司生产)；AUW120D 型电子分析天平(日本岛津公司生产，十万分之一)；TG16-W 台式高速离心机(长沙维尔康湘鹰离心机有限公司生产)；PBB对照品(中国药品生物制品鉴定所提供，批号：171222-200504)；试验用水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 um)；柱温：30℃；流动相：甲醇-水(40：60，V：V)；流速：1.0 mL·min；检测波长：214nm；进样量：10pL。 2.2 PBB标准溶液的配制 精密称取 PBB 5.0 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得50.0 pg'mL'PBB 贮备液，精密吸取 PBB贮备液2 mL 置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得10.0 pgmL-'PBB 甲醇溶液，冰箱(4℃)保存。 2.3 血清样品的配制 取离心管数支，分别精密加人适量不同浓度的 PBB标准溶液，氮气流吹干后，加入血清0.5 mL，配成血清中含PBB分别为相应浓度的标准血清样品和质控样品。 2.4 血清样品处理方法 于离心管中精密加入血清样品0.5 mL，加甲醇1mL，涡 旋混合3 min，12 000 r·min'离心5 min 后取上清液于另一离心管中在相同条件下二次离心，吸取上清液用 0.22 p.m的滤头滤过后置于自动进样分析小瓶中，精密吸取10 p.L进样分析。 2.5 专属性试验 在上述条件下，PBB的保留时间为 8.2 min 左右。目标化合物峰形良好，能有效分离，无杂峰干扰测定，基线平稳，见图1。 mV 图1 HPLC 色谱图 Fig 1 HPLC chromatograms A苯巴比妥标准溶液；B苯巴比妥标准溶液+空白血清；C空白血清 A. phenobarbital standard solution； B. phenobarbitalstandard solution plus blank serum； C. blank serum 2.6 PBB标准曲线的制作与定量下限的测定 取离心管数支，分别精密加入4.5、9.1、18.2、36.4、72.8 pag*mL"系列浓度的 PBB 血清样品，平行做5份样品，按“2.4血清样品处理方法”项下操作，记录色谱图，以血清中 PBB的浓度(C)对 PBB 样品峰面积的平均值(A)做回归曲线(见图2)，得回归方程为：C=7.462 79×10A+1.224 25(r=0.999 9)。PBB血清浓度在4.5~72.8 pg·mL-范围内线性关系良好。信噪比以 S/N=3：1计，PBB 的最低监测限为0.5 ugmL-。 2.7 重复性试验 取 PBB标准液适量于离心管中，氮气流吹干后，加空白血清0.5 mL混匀，按“2.4血清样品处理方法”项下操作，平行做5管，记录色谱图，代人标准曲线方程计算 PBB 的血药浓度，精密度( RSD)=1.26%(n=5)。结果表明该方法重复性良好。 2.8 回收率和精密度试验 取离心管数支，分别取PBB 标准液适量于离心管中，氮气 图2 标准曲线图 Fig 2 Stand curve chart 流吹干后，加空白血清0.5mL，配成浓度分别为4.5、36.4、72.8 pg'mL'的 PBB 溶液，按“2.4血清样品处理方法”项下操作，记录色谱图，每个样品测定5次取平均值，代入标准曲线方程计算 PBB 的血药浓度，以实测值与加入质量浓度之比计算回收率。将以上低、中、高3种浓度的样品溶液做为质控样品，分别在同一天内测定5次计算日内精密度和连续3日内每日测定1次计算日间精密度，见表1。 表1 回收率和精密度试验结果(n=5) Tab 1 Results of recovery test and precision test (n=5) 血中浓度/ 实测浓度 相对 平均相对 RSD/% 平均值/ 回收率/ 回收率/ pg'mL- 日内 日间 g'mL- % % 4.5 4.3 95.56 3.21 3.08 36.4 35.9 98.63 96.92 2.64 4.38 72.8 70.3 96.57 2.74 3.12 2.9 稳定性试验 取离心管数支，精密加入 PBB 浓度分别为4.5、36.4、72.8 pugmL的质控样品0.5 mL，平行制备5份，一份制备好按"2.4血清样品处理方法"项下操作后立即进样分析(A)；一份于室温下放置4h，同法操作(B)；一份提取后于4℃放置12h，进样分析(C)；一份于冰箱中冷冻保存4周后取出融化，同法操作(D)；另一份在4周内反复冻融3次，然后同法操作(E)。结果显示样品在不同的储存条件下对本试验方法均具有良好的稳定性，见表2。 表2 血清中 PBB的浓度平均值(pg·mL-) 加人浓度 A B C D E RSD/% 4.5 4.44 4.05 3.87 4.32 4.29 5.41 36.4 35.81 33.53 35.40 36.77 32.58 4.90 72.8 72.66 71.54 70.24 74.23 69.55 2.61 3 讨论 根据临床用药情况，对一些药物进行了测试，结果发现，地西泮、卡马西平、苯妥英、丙丙酸、氯丙嗪等均不干扰 PBB 的测定，说明本法可应用于 PBB的血药浓度监测，患者如同时服用其他药物不会影响 PBB 的测定。文献报道的检测波长有245[2205*2406]254214 nml)等。试验结果显示检测波长为214 nm 时其血清组分干扰最小、吸收值较大、灵敏度较高，所以选取214 nm 作为检测波长。选择沉淀剂时分别试 用15%高氯酸、乙腈、甲醇，发现用15%高氯酸沉淀时回收率较低，乙腈和甲醇作为沉淀剂均能达到要求。考虑到甲醇毒性较低，更为安全，故选择甲醇作为沉淀剂。提高柱温可以降低流动相的黏度，增加样品在流动相中的溶解度，减少保留时间，故控制温度可调整其出峰时间。经过对不同柱温的测试，发现30~40℃时，PBB的出峰较好。比较30354.5140℃(8]时 PBB的吸收峰分离度、峰形、拖尾因子等并无明显差异，为了延长色谱柱筹命并避免环境温度影响，故选择30℃作为柱温。一般作体外药物分析时均采用外标法，体内药物分析因提取步骤繁琐都采用内标法进行校正，但因为本方法仅仅使用甲醇沉淀蛋白，无提取等繁琐步骤，而且仪器稳定性、方法重现性均良好，故选择用外标法定量测定。另外，因本方法使用的高效液相色谱仪为自动进样系统，避免了进样体积的误差。使用手动进样系统能否达到良好的效果，尚需进一步研究。本法的苯巴比妥样品出峰时间在 8.2 min 左右，整个测定过程从抽血到测定完成仅需要不到1h的时间，满足临床血药浓度简捷、快速的测定要求。 本文建立的 HPLC 外标法测定血清中 PBB 的血药浓度，方法简单，便于推广。本方法直接采用甲醇和水为流动相，节约了成本。所以本方法除了具备灵敏度高、重重性好、专一性.强的基本要求外，还具有操作简捷、价格低廉等优点，是一种理想的血药浓度测定方法。我院已将该法应用于临床，常规监测PBB 的血药浓度。 ( 参考文献 ) ( [ 1] 王兰君，李国兴.苯巴比妥血药浓度监测与临床疗效 的相关性分析[J].放射免疫学杂志，2009，22(5)：521- 522. ) ( [ 2 ] 余 勤，梁茂植，向 瑾，等.EMIT 法和 HPLC 法监测 苯妥英和苯巴比妥血药浓度比较研究[J].检验医学， 2007，22(4)： 4 55-458. ) ( [ 3 ] 田 军，刘玉华.差式紫外分光光度法测定小儿苯巴 比妥血药浓度[J].中国新医药，2004，3(7)：103-104. ) ( [ 4] 李碧峰，冯惠平，贾晋蓉，等. 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