猪中非洲猪瘟病毒Archimed的适用性试验检测方案(PCR)

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Arrchimed Application Note-非洲猪瘟荧光定量 PCR 检测 利用 Archimed 定量 PCR进行非洲猪瘟病毒检测 Welcome to Archimed Analyzer ROCGENE 扩增曲线 ■检测项目1 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 非洲猪瘟荧光定量 PCR分析 2018年8月非洲猪瘟疫情在中国爆发，爆发地区分布交广，对我国畜牧养殖造成了巨大损失。我国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，非洲猪瘟(ASF) 是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病，对生猪致病率高，致死率高达100%。 应用实时荧光 PCR 技术可以从低微含毒量样品中扩增获得病毒特异性核酸片段，进行病毒鉴定。通过扩增捕获 ASFV 主要免疫原基因VP72， 进而测定其核酸序列，可进行以毒株间核苷酸序列同源性比较为主要技术手段的非洲猪瘟分子流行病学研究。 利用Archimed 荧光定量PCR 进行非洲猪瘟检测一般流程 为了帮助实验人员更便捷地进行非洲猪瘟检测，Archimed定量 PCR在实验条件设置、孔板设置及数据分析等方面均进行了充分优化，力争以最智能化的方式帮助研究者完成该类型实验。利用 Archimed 软件智能设置向导，完成一个非洲猪瘟荧光定量 PCR 分析实验只需简单的6个步骤： 1. 创建实验：点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择"创建"，可以创建全新的实验流程；选择实验类型：根据实际使用的实验类型进行选择，这里选择相对绝对定量。 2. 设置反应条件：实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面 .设置孔板：运行条件设置完成后，点击页面左侧孔板设置或者右下角的下一步，进入孔板设置界面。根据实际反应管放置的相应孔位选择反应孔，对样本及检测项目进行相应属性设置，并勾选分配至对应孔位中，待测样品孔位将显示相应设置属性 注： Archimed孔板设置可以在反应运行前、运行中、或运行后设置，运行中或运行后进行孔板设置可以节省时间。 4. 运行实验：运行条件或孔板设置完成后，点击页面左侧实验运行或右下角的下一步，进入仪器运行界面 5. 结果查看及分析：运行完成后， Archimed 软件将使用默认分析设置自动分析数据，结果分析界面中显示扩增图谱。 6.导出结果：单击导出按钮，结果会果示在一个打开的 Excel 中，表格中包含孔板设置、扩增数据、多组分数据、结果等 sheet； 用于数据分析的 Ct 值相关参数等信息会在结果表格中展示 应用实例分享(一)——利用Archimed 进行非洲猪瘟荧光定量 PCR 分析 以下我们将以一个真实实验为例，展示利用 Archimed 定量 PCR 进行非洲猪瘟荧光定量 PCR 分析的实验结果。该实验是四川某公司用郑州中道生物——非洲猪瘟病毒荧光 PCR检测试剂盒(荧光探针法)进行实验。 材料和方法： 试剂和耗材： ●样本：未知猪血液提取 DNA。 ● 试剂：郑州中道生物——非洲猪瘟病毒荧光 PCR检测试剂盒(荧光探针法) ● BIO-RAD八联管 仪器： ●品牌： Rocgene (鲲鹏基因) 型号：Archimed X6 实时荧光定量PCR仪 反应体系： ● PCR反应液：17pl 酶混合液：3pL 样本：5pL ● Total ： 25pL 反应程序： 实验结果 阳性标准品为 Ct 值为19.3，阴性样本Ct 值为 undetermined。 【结果判定】 1、基线和阈值设定：基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定以阈值直刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点为原则。 2、质量控制：反应结束后，阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线， Ct 值为>38或无；阳性对照的Ct 值应≤30.0，且无明显的扩增曲线；否则实验视为无效。 3、样品判定：待检样品荧光信号有指数型增加，且结果显示 Ct 值<35.0，报告为阳性；未检测到 Ct 值或 Ct值>38或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。3538或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。35≤Ct值<38时，复检一次，重复结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。 扩增曲线结果： 阳性对照 1.2 2 检测项目1 应用实例分享(三)——利用Archimed 进行非洲猪瘟荧光定量 PCR分析 以下我们将以一个真实实验为例，展示利用Archimed 定量 PCR 进行非洲猪瘟荧光定量 PCR 分析的实验结果。该实验是用唐山怡安——非洲猪瘟病毒荧光 PCR检测试剂盒(荧光探针法)进行实验。 材料和方法： 试剂和耗材： ●样本：未知猪血液提取 DNA。 试剂：唐山怡安——非洲猪瘟病毒荧光 PCR检测试剂盒(荧光探针法) ● BIO-RAD 八联管 仪器： ●品牌：Rocgene (鲲鹏基因) ● 型号： Archimed X6 实时荧光定量PCR仪 反应体系： ● PCR反应液：20pl ● 样本：5uL Total ： 25pL 反应程序： 实验结果 阳性标准品为11.3，阴性样本为 undetermined. 【结果判定】 1.试验成立条件： 1.1阴性对照品 FAM 检测通道无S型扩增曲线；。 1.2阳性对照品 FAM检测通道有典型S型扩增曲线曾 Ct 值s23； 1.3阴、阳性对照品检测符合上述结果，则实验有效。 2.结果判定 2.1如果样本在 FAM 通道有典型S型扩增曲线且 Ct 值23，贝判定为非洲猪瘟病毒核酸检测阳1性； 2.2如果 FAM 通道有典型S型扩增曲线且 Ct值在23-30之间，则需要复检。复检结果如果样本 FAM 通道仍有典型S型扩增曲线且 Ct 值≤30，则判定为非洲猪瘟病毒核酸检测阳性，否则为阴性。 扩增曲线结果： 扩增曲线 1.025447 讨论 _进行非洲猪瘟荧光定量 PCR 检测实验，实验结果往往受到样品质量及实验操作的极大影响。在实验样本及实验操作无较大隐患的基础上， Archimed 荧光定量 PCR仪具有极佳的实验结果重复性及特异性，确保实验人员不存在对于实验设备的后顾之忧。 一 对病猪的临床诊治应结合其症状/体征病史，其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。检测为阴性，并不代表为非感染状态，具体诊断结果须结合其他临床诊诊结果判断。造成检测为阴性的可能是：①不合理样本采集、转运及处理、样本中病毒浓度过低，②未经验证的其他干扰因素如：服用抗病毒药物等。样本中 DNA浓度低于本产品的最低检出限时可能出现假阴性。核酸反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检检各荧光定量PCR 反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 注意事项 ●实验前请仔细阅读试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得好的结果。 ● 实验室应严格按照有关规定分区管理。各区间人员、器材材剂及空气流向应有严格要求。 ● 有关耗材确保清洁、无菌，核酸提取完成后尽快进入下一步实验或冷冻保存。 预混后的试剂应尽量在短期内使用完毕，户外使用应在加冰袋的泡沫盒保存，每日试验完毕应及时冷冻保存。 对于荧光 PCR 管要避免徒手或使用过的手套接触，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套。 ● 冻存试剂使用前应于室温下完全融化，瞬时离心使液体完全沉于管底。 样品、阴性对照封盖后，在通风环境添加阳性对照并及时封盖，避免组分间及气溶胶等假阳性污染。 ● 试验扩增完毕后的 PCR 管严禁开盖，应与产生的其它废弃物及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理。 关于 Archimed 荧光定量 PCR 系统 Archimed 荧光定量 PCR 是因鹏基因为满足中高端用户的切实需求而匠心打造的全球首款时间分辨实时荧光定量 PCR 系统。基于菲涅尔透镜的新型光信号采集技术、专利的时间分辨信号分离技术及独特的控温技术，使Archimed 系列产品在检测灵敏度、多色串扰、温度均一性及准确性等方面达到国际先进水平。同时，基于全球视野的产品设计理念及制造工艺，赋予 Archimed 国际水准的优异品质。Archimed 将秉承中国智造、追求卓越的工匠精神，携手中国用户成就未来。 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 地址：北京市昌平区龙域北街10号创集合产业园429室电话：010-59724295 邮编：102208 网址： www.rogene.com Archimed荧光定量 PCR系统     鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司（以下简称鲲鹏基因）已经为多家疫病预防研究和检测机构，包括牧原股份、中科基因、新希望六和等，提供了专业的非洲猪瘟病毒检测解决方案。在此期间，鲲鹏基因携旗下自主研发的Archimed荧光定量PCR仪对多款现已获批的非洲猪瘟病毒检测试剂盒进行了实际测试，包括唐山怡安生物、郑州中道生物、北京明日达生物等。实测结果数据表明Archimed对不同公司研发的非洲猪瘟病毒检测试剂盒具有极高的兼容性。以下是其中一个实际测评结果案例。 唐山怡安生物——非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（荧光探针法，免提取）     检测原理 以PCR方法结合荧光探针，核酸提取与纯化同步操作，直接通过实时监测PCR扩增产物的累积过程中荧光信号的变化对非洲猪瘟病毒的特异性核算片段进行检测。     反应体系：25μL体系     经预处理的样本：5μL ASFV-PCR    反应液：20μL     荧光通道的选择：FAM 通道     检测项目为：ASFV反应条件 结果：扩增曲线清晰地区分了阳性对照和阴性对照。