多肽样品中分离纯化检测方案(制备液相色谱)

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C18AQ柱在强极性多肽样品分离纯化方面的应用 应用技术研究中心 背景介绍 多肽是由氨基酸组成的化合物，每一条多肽因组成其序列的氨基酸残基种类和排列顺序不同，有着独特的物理和化学性质。随着固相化学合成法的发展，各种活性多肽的化学合成有了很大的进展，但是固相合成法得到的多肽一般成分比较复杂，最终产物必须经过可靠的分离手段进行纯化。常用的多肽分离纯化方法包括离子交换色谱法（IEC）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）等，这些方法存在样品载量低、分离介质价格昂贵、分离设备复杂且成本高昂等缺点。对于小分子多肽（分子量低于1kD）的快速制备纯化，三泰科技在之前已发布过成功的应用案例，利用SepaFlash®反相C18分离柱对胸腺五肽样品进行了快速分离纯化，获得了满足需求的目标产物。 图1. 20种常见氨基酸的化学结构式。 常见的组成多肽的氨基酸有20种，根据其极性和酸碱性可以分为以下几组：非极性（疏水）、极性（不带电荷）、酸性以及碱性（参见图1）。在一条多肽序列中，如果组成该多肽的氨基酸大多为极性氨基酸（图1中粉红色标出部分），如半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等，那么该多肽可能具有较强的极性，易溶于水。在对该类强极性多肽样品的反相色谱制备纯化过程中，若采用普通的C18分离柱，将会发生疏水坍塌现象（具体请参见三泰科技之前发布的应用案例——《疏水坍塌与AQ反相色谱柱的应用》）。而改良后的C18AQ柱可以很好的适用于强极性或强亲水性样品的分离纯化，在本案例中，利用某强极性多肽作为样品，在C18AQ柱上进行了分离纯化，获得了可用于下一步研究的目标产物。 实验部分 本文中所用样品为客户实验室提供的分子量1kD的合成多肽，其氨基酸序列中含有多个极性氨基酸残基，因此样品具有很强的极性，粗品纯度约为80%。取60mg白色粉末状粗品固体，溶于5 mL纯水中，超声使样品完全溶解为澄清透明溶液。利用注射器将样品溶液上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。 表1. Flash制备纯化实验参数设置 仪器 SepaBeanTM machine 2 色谱柱 12 g SepaFlash® C18反相分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP) 12 g SepaFlash® C18AQ反相分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP(AQ)) 检测波长 254 nm, 220 nm 214 nm 流动相 溶剂A：水； 溶剂B：乙腈 流速 15 mL/min 20 mL/min 进样量 30 mg 洗脱梯度 时间 (CV) 溶剂B (%) 时间 (min) 溶剂B (%) 0 0 0 4 1.0 0 1.0 4 10.0 6 7.5 18 12.5 6 13.0 18 16.5 10 14.0 22 19.0 41 15.5 22 21.0 41 18.0 38 / / 20.0 38 22.0 87 29.0 87 结果与讨论 为了比较普通C18分离柱与C18AQ柱对极性多肽样品的分离纯化效果，我们首先利用普通C18分离柱对样品进行了Flash制备纯化实验，分离图谱如图2所示。分析图2可知，由于高比例水相造成的固定相疏水坍塌，多肽样品在普通C18柱上基本没有保留，直接被流动相洗脱下来，因此没有得到有效的分离纯化。 图2. 样品在普通C18分离柱上的Flash纯化色谱图。 接下来我们利用C18AQ柱对样品进行了Flash制备纯化，分离图谱如图3所示。分析图3可知，多肽样品在C18AQ柱上获得了有效地保留，粗品中的杂质也得到了有效地分离。将收集组分进行冻干处理后，经HPLC分析，所得纯化产物的纯度约为98.2%，可以用于下一步的研究开发。 图3. 样品在C18AQ分离柱上的Flash纯化色谱图。 因此，对于强极性或亲水性很强的样品的分离纯化，SepaFlash® C18AQ反相分离柱配合SepaBeanTM machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。 关于SepaFlash® C18AQ反相分离柱系列产品 三泰科技推出的SepaFlash® C18AQ反相分离柱系列产品具有多种规格（参见表2）。 表2. SepaFlash® C18AQ反相分离柱参数 （填料:High-efficiency spherical C8(AQ), 20 – 45 μm, 100 Å） Item Number Column Size Flow Rate (mL/min) Max.Pressure (psi/bar) SW-5222-004-SP(AQ) 5.4 g 5-15 400/27.5 SW-5222-012-SP(AQ) 20 g 10-25 400/27.5 SW-5222-025-SP(AQ) 33 g 10-25 400/27.5 SW-5222-040-SP(AQ) 48 g 15-30 400/27.5 SW-5222-080-SP(AQ) 105 g 25-50 350/24.0 SW-5222-120-SP(AQ) 155 g 30-60 300/20.7 SW-5222-220-SP(AQ) 300 g 40-80 300/20.7 SW-5222-330-SP(AQ) 420 g 40-80 250/17.2 如需进一步了解SepaBeanTM machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https://store.chembeango.com/。 实验部分本文中所用样品为客户实验室提供的分子量1kD的合成多肽，其氨基酸序列中含有多个极性氨基酸残基，因此样品具有很强的极性，粗品纯度约为80%。取60mg白色粉末状粗品固体，溶于5 mL纯水中，超声使样品完全溶解为澄清透明溶液。利用注射器将样品溶液上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。表1. Flash制备纯化实验参数设置仪器SepaBeanTM machine 2色谱柱12 g SepaFlash® C18反相分离柱(球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP)12 g SepaFlash® C18AQ反相分离柱(球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP(AQ))检测波长254 nm, 220 nm214 nm流动相溶剂A：水；溶剂B：乙腈流速 15 mL/min20 mL/min进样量30 mg洗脱梯度时间 (CV)溶剂B (%)时间 (min)溶剂B (%)00041.001.0410.067.51812.5613.01816.51014.02219.04115.52221.04118.038//20.03822.08729.087结果与讨论    为了比较普通C18分离柱与C18AQ柱对极性多肽样品的分离纯化效果，我们首先利用普通C18分离柱对样品进行了Flash制备纯化实验，分离图谱如图2所示。分析图2可知，由于高比例水相造成的固定相疏水坍塌，多肽样品在普通C18柱上基本没有保留，直接被流动相洗脱下来，因此没有得到有效的分离纯化。图2. 样品在普通C18分离柱上的Flash纯化色谱图。   接下来我们利用C18AQ柱对样品进行了Flash制备纯化，分离图谱如图3所示。分析图3可知，多肽样品在C18AQ柱上获得了有效地保留，粗品中的杂质也得到了有效地分离。将收集组分进行冻干处理后，经HPLC分析，所得纯化产物的纯度约为98.2%，可以用于下一步的研究开发。图3. 样品在C18AQ分离柱上的Flash纯化色谱图。因此，对于强极性或亲水性很强的样品的分离纯化，SepaFlash® C18AQ反相分离柱配合SepaBean® machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。关于SepaFlash® C18AQ反相分离柱系列产品三泰科技推出的SepaFlash® C18AQ反相分离柱系列产品具有多种规格（参见表2）。表2. SepaFlash® C18AQ反相分离柱参数（填料:High-efficiency spherical C8(AQ), 20 – 45 μm, 100 Å）Item NumberColumn SizeFlow Rate(mL/min)Max.Pressure(psi/bar)SW-5222-004-SP(AQ)5.4 g5-15400/27.5SW-5222-012-SP(AQ)20 g10-25400/27.5SW-5222-025-SP(AQ)33 g10-25400/27.5SW-5222-040-SP(AQ)48 g15-30400/27.5SW-5222-080-SP(AQ)105 g25-50350/24.0SW-5222-120-SP(AQ)155 g30-60300/20.7SW-5222-220-SP(AQ)300 g40-80300/20.7SW-5222-330-SP(AQ)420 g40-80250/17.2