冠醚类衍生物中样品的分离纯化检测方案(制备液相色谱)

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SepaBean machine T四元溶剂系统应用于冠醚类衍生物样品的分离纯化SANTAITECHNOLOGIES地总 址：江苏省常州市新北区庆阳路78号销售部信箱： sales@santaitech.com机：0519-85150175销售部：400-625-6069客户服务信箱： service@santaitech.com应用技术研究中心信箱： SAT@santaitech.com 背景介绍 冠醚是一种杂环有机化合物，包含有多个醚基团。最常见的冠醚是乙撑氧的低聚物，其中重复的单位是乙烯氧基(-CH2CH2O-)。冠醚类系列化合物中最重要的是四聚体、五聚体和六聚体。之所以用“冠”来命名，是因为就像皇冠可以戴在头上一样，冠醚能够和一个阳离子成键。在冠醚的命名法中，前面那个数字代表了环内的总原子数，第二个数字代表环内氧原子的个数。冠醚的概念远远大于乙撑氧的低聚物，另外一个很重要的系列是邻苯二酚的衍生物。 1967年，杜邦公司的化学家查尔斯-彼得森在试冠醚。彼得森发现他合成的环多醚实际上是一类全新的化合物，有着与碱金属结合的能力。接下来，他发表了一系列的论文报告了经过系统研究的合成方法以及冠醚的成键性质2。很多不同学科受益于冠醚的发现，包括有机合成、相转移催化等。彼得森因为发现了冠醚的合成方法及及性质，而分享了1987年的诺贝尔化学奖。 冠醚的特殊性质在于其对碱金属及碱土金属阳离子的很强的配位能力，并且这种配位作用随着醚环空穴尺寸、杂原子的种类以及原子数目的不同而对特定金属离子表现出明显的选择性。作为配位化学、萃取化学、相转移催化、离子选择性载体等诸多领域的主题化合物，冠醚已经吸引了越来越多的关注[3-8]冠醚化合物上的取代基团性质的不同会影响其与金属离子的络合强度、选择性及溶解性。相比于未取代的冠醚，苯并冠醚因其更佳的亲脂性而在研究中更受关注19，10]。但后者在性极性溶剂中并不优良的溶解性，使之难以直接应用。为了改善苯并冠醚类化合物的性质，近年来很多研究人员将工作重心集中在苯并冠醚衍生物的研究和开发上。 在本应用案例中，样品为合成反应获得的苯并冠醚衍生物，该样品体系复杂，包含多种不同极性的组分，利用常规二元溶剂梯度进行纯化时很难获得良好的分离度。针对样品的具体性质，三泰科技的应用工程师利用四元溶剂系统SepaBean machine T配合SepaFlash正相硅胶柱，通过不同极性溶剂的在线切换，成功对样品进行了制备纯化，获得了满足制备需求的目标产物，为此类组分极性差异很大的复杂样品 体系的分离纯化提供了一种可行的方案。 实验部分 本文中待纯化的样品来自某高校实验室，为合成的苯并冠醚衍生物类分子，其分子结构式示意图请参见图1。样品体系复杂，各组分极性差异很大，样品在弱极性有机溶剂中溶解度不佳，必须采用二氯甲烷作为溶剂才能完全溶解。 图1.苯并冠醚衍生物类样品分子结构式示意图。 取4.9g固体样品粉末溶于少量二氯甲烷中，利用适量硅胶(200~400目)进行拌样后将溶剂旋蒸处理干净，取少量样品经一根4g SepaFlash iLOK空柱(订货号：SD-0000-004)进行固体上样。样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。 表1.Flash制备纯化实验参数设置。 仪器 SepaBean machine T 分离柱 12 g SepaFlash@正相分离柱(无定形硅胶，40 -63 um，60A，订货号：S-5101-0012) 25 g SepaFlash正相分离柱(无定形硅胶， 40-63 pm， 60 A，订货号：S-5101-0025) 检测波长 254 nm， 280 nm 流动相 溶剂A：二氯甲烷；溶剂B：甲醇 溶剂A：正己烷；溶剂B：乙酸乙酯溶剂C：二氯甲烷；溶剂D：甲醇 流速 25 mL/min 30 mL/min 进样量 500 mg (约含有250 mg 样品) 3.0g(约含有1.5g样品) 洗脱梯度 时间(CV) 溶剂B(%) 时间(CV) 溶剂B(%) 溶剂D(%) 0 0 0 0 / 4.0 0 3.0 0 / 13.5 10 6.0 16 / 19.0 10 10.0 16 / 23.5 16 20.0 50 / 23.8 100 30.0 50 / 28 100 44.0 80 / 44.5 100 / 63.0 100 / 63.1 / 0 85.0 / 4.0 110 / 4.0 考虑到样品的性质，我们首先利用常规的二元溶剂体系二氯甲烷/甲醇作为流动相，对上样后的分离柱进行洗脱，样品在此条件下的Flash制备图谱如图2所示， 图2.样品在二元溶剂体系下的Flash分离图谱。 分析图2可知，以二氯甲烷/甲醇体系作为流动相时，样品可以在正相硅胶柱上获得足够的保留时间，但是其中的组分没有获得有效分离。分析样品的合成路径，参考经典的二苯并18-冠-6的合成路线(如图3所示)，可知此类样品体系中除了非极性(亲脂性很强)的目标产物外，还含有过量或未反应完全的强极性原料(如邻苯二酚)或其他副产物，因此样品体系中含有多种不同极性的组分。当采用简单的二元溶剂梯度时，由于二氯甲烷/甲醇体系适用于极性较强的组分，对于弱极性组分的选择性就不如正己烷/乙酸乙酯这样的溶剂体系。因此，对于含有从弱极性组分到强极性组分的复杂样品体系，作为对简单二元溶剂系统的改进，选取不同选择性的二元溶剂系统对色谱柱进行连续洗脱，可以获得对复杂样品体系中各组分更好的分离度。 图3.二苯并18-冠-6的合成路线图。 参考Snyder溶剂选择性三角形(如图4所示)依据其不同的酸性、碱性及偶极性质，常用溶剂可以大致分为8组，每组溶剂在这个三角形中各自占据一定位置。根据相似相容原理，不同组别的溶剂对样品具有不同的选择性。因此，通过优化溶剂组合，可以获得对样品更佳的选择性，从而优化样品分离效果。 回到之前实验条件中选择的常规二元溶剂体系：二氯甲烷/甲醇体系，查询溶剂极性参数表(参见表2)，可知二氯甲烷和甲醇的极性参数P’分别为3.1和5.1，而正相分离中常用的正己烷和乙酸乙酯的极性参数P'分别为0.1和4.4，对比这两种常用的正相溶剂体系可知，对于组分极性分布范围较大的复杂样品体系，若能同时采用这两种溶剂体系进行连续洗脱，将获得对样品中各组分最佳的分离度。 表2.常用溶剂的极性参数P’。 溶剂 P' 溶剂 P' 溶剂 P' 正戊烷 0.0 正丙醇 4.0 丙酮 5.1 正己烷 0.1 四氢呋喃 4.0 甲醇 5.1 苯 2.7 氯仿 4.1 乙腈 5.8 乙醚 2.8 乙醇 4.3 乙酸 6.0 二氯甲烷 3.1 乙酸乙酯 4.4 水 10.2 常规配置二元溶剂系统的Flash制备色谱仪通过一台系统泵配合二元比例阀产生流动相梯度，这种配置的仪器在进行需要同时更换两种溶剂的连续梯度洗脱时，就必须将Flash柱从仪器上取下，然后利用后续待使用的新溶剂冲洗管路，再次装上Flash柱后进行后续分离实验。这些操作无疑增加了实验人员的工作量，降低了实验效率。SepaBean machine T采用四元比例阀系统，可以从四路溶剂中任意选择两种作为流动相进行梯度洗脱，因此使得实验中在不同流动相体系之间连续在线切换成为了可能。在接下来的实验中，我们选择了正己烷/乙酸乙酯过渡至二氯甲烷/甲醇体系，对样品进行了连续洗脱，Flash制备纯化实验参数设置参见表1，样品在此条件下的Flash制备图谱如图5所示。 图5.样品在四元元溶剂体系下的Flash分离图谱。 分析图5可知，在Flash分离实验第一阶段，采用正己烷/乙酸乙酯体系作为洗脱溶剂，首先将样品中极性较弱的组分从Flash柱上洗脱下来；在第二阶段，采用二氯甲烷/甲醇体系作为洗脱溶剂，可以进一步将样品中极性较强的组分从Flash柱上洗脱下效来，从而使得样品中不同极性的各组分分别得到有分离和收集。对收集组分进行TLC点板确认，采用0.5%高锰酸钾溶液作为显色剂，利用热风枪对TLC板烘烤5min后，粗品及收集组分的显色结果如图6所示确认各组分已得到有效分离，可以应用于下一步的研究开发中。 图6.粗品及收集组分的TLC点板实验结果。 结论 对于苯并冠醚衍生物类复杂样品体系，由于其中组分极性分布范围广，常规二元溶剂体系很难对样品中各组分获得良好的分离度，利用四元溶剂系统SepaBean machine T ， 对不同极性的洗脱溶剂体系进行连续在线切换，最终获得了更好的纯化效果，为此类复杂样品体系的制备纯化提供了一种便捷高效的解决方案。 如需进一步了解SepaBean machine T的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店： store.chembeango.com ( 参考文献 ) ( 1. C. J. Pedersen， J. Am. Chem. Soc.， 1967， 89，7017-7036. ) ( 2. C. J . Pedersen， O r g. Synth. Coll. V o l.， 1 988， 6， 395. ) ( 3. S. R. Cooper， Crown Compounds： T o ward FutureApplications， 1992， Chichester： Wiley InterScience. ) ( 4. M . H iraoka， Crown Ethers and Analogous Compounds， 19 9 2， Amsterdam： Elsevier. ) ( 5. H.， Schneider， A . K. Yatsimirsky， Principles and Methods inSupramolecular Chemistry， 2000， Chichester： John Wiley. ) ( 6. P. J . Cragg， A Practical Guide to Supramolecular Chemistry， 2005， Chichester： John W iley. ) ( 7. G.W. Gokel， W. M. Leevy， M . E. Weber， C hem. Rev， 2 0 04， 104，2723-2750. ) ( 8. J. Li， D . Yi m ， W. Jang， et al， Chem. Soc. R ev.，2 0 17， 46， 2437-2458. ) ( 9. U. Olsher， J. Am. Chem. Soc. ， 1982 ， 104，4006-4007. ) 10. R. A. Bartsch， Y. Liu， S. I. Kang，et al， J. Org. Chem.，1983，48，4864-4869. 三泰科技(常州)有限公司 ( 产品订购信箱：order@santaitech.com ) ( 技术支持信箱： support@santaitech.com ) 实验部分本文中待纯化的样品来自某高校实验室，为合成的苯并冠醚衍生物类分子，其分子结构式示意图请参见图1。样品体系复杂，各组分极性差异很大，样品在弱极性有机溶剂中溶解度不佳，必须采用二氯甲烷作为溶剂才能完全溶解。 图1. 苯并冠醚衍生物类样品分子结构式示意图。取4.9 g固体样品粉末溶于少量二氯甲烷中，利用适量硅胶（200~400目）进行拌样后将溶剂旋蒸处理干净，取少量样品经一根4g SepaFlash iLOK空柱（订货号：SD-0000-004）进行固体上样。样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。表1. Flash制备纯化实验参数设置。仪器SepaBean® machine T色谱柱12 g SepaFlash® 正相分离柱(无定形硅胶, 40 - 63 μm, 60 Å, 订货号：S-5101-0012)25 g SepaFlash® 正相分离柱(无定形硅胶, 40 - 63 μm, 60 Å, 订货号：S-5101-0025)检测波长254 nm, 280 nm流动相溶剂A：二氯甲烷；溶剂B：甲醇溶剂A：正己烷；溶剂B：乙酸乙酯溶剂C：二氯甲烷；溶剂D：甲醇流速25 mL/min30 mL/min进样量500 mg (约含有250 mg样品)3.0 g (约含有1.5g样品)洗脱梯度时间 (CV)溶剂B (%)时间 (CV)溶剂B (%)溶剂D (%)0000/4.003.00/13.5106.016/19.01010.016/23.51620.050/23.810030.050/2810044.080/44.5100/63.0100/63.1/085.0/4.0110/4.0结果与讨论考虑到样品的性质，我们首先利用常规的二元溶剂体系二氯甲烷/甲醇作为流动相，对上样后的分离柱进行洗脱，样品在此条件下的Flash制备图谱如图2所示。 图2. 样品在二元溶剂体系下的Flash分离图谱。分析图2可知，以二氯甲烷/甲醇体系作为流动相时，样品可以在正相硅胶柱上获得足够的保留时间，但是其中的组分没有获得有效分离。分析样品的合成路径，参考经典的二苯并18-冠-6的合成路线（如图3所示），可知此类样品体系中除了非极性（亲脂性很强）的目标产物外，还含有过量或未反应完全的强极性原料（如邻苯二酚）或其他副产物，因此样品体系中含有多种不同极性的组分。当采用简单的二元溶剂梯度时，由于二氯甲烷/甲醇体系适用于极性较强的组分，对于弱极性组分的选择性就不如正己烷/乙酸乙酯这样的溶剂体系。因此，对于含有从弱极性组分到强极性组分的复杂样品体系，作为对简单二元溶剂系统的改进，选取不同选择性的二元溶剂系统对色谱柱进行连续洗脱，可以获得对复杂样品体系中各组分更好的分离度。 图3. 二苯并18-冠-6的合成路线图。参考Snyder溶剂选择性三角形（如图4所示），依据其不同的酸性、碱性及偶极性质，常用溶剂可以大致分为8组，每组溶剂在这个三角形中各自占据一定位置。根据相似相容原理，不同组别的溶剂对样品具有不同的选择性。因此，通过优化溶剂组合，可以获得对样品更佳的选择性，从而优化样品分离效果。 图4. Snyder溶剂选择性三角形示意图。回到之前实验条件中选择的常规二元溶剂体系：二氯甲烷/甲醇体系，查询溶剂极性参数表（参见表2），可知二氯甲烷和甲醇的极性参数P’分别为3.1和5.1，而正相分离中常用的正己烷和乙酸乙酯的极性参数P’分别为0.1和4.4，对比这两种常用的正相溶剂体系可知，对于组分极性分布范围较大的复杂样品体系，若能同时采用这两种溶剂体系进行连续洗脱，将获得对样品中各组分最佳的分离度。表2. 常用溶剂的极性参数P’。溶剂P’溶剂P’溶剂P’正戊烷0.0正丙醇4.0丙酮5.1正己烷0.1四氢呋喃4.0甲醇5.1苯2.7氯仿4.1乙腈5.8乙醚2.8乙醇4.3乙酸6.0二氯甲烷3.1乙酸乙酯4.4水10.2常规配置二元溶剂系统的Flash制备色谱仪通过一台系统泵配合二元比例阀产生流动相梯度，这种配置的仪器在进行需要同时更换两种溶剂的连续梯度洗脱时，就必须将Flash柱从仪器上取下，然后利用后续待使用的新溶剂冲洗管路，再次装上Flash柱后进行后续分离实验。这些操作无疑增加了实验人员的工作量，降低了实验效率。SepaBean machine T采用四元比例阀系统，可以从四路溶剂中任意选择两种作为流动相进行梯度洗脱，因此使得实验中在不同流动相体系之间连续在线切换成为了可能。在接下来的实验中，我们选择了正己烷/乙酸乙酯过渡至二氯甲烷/甲醇体系，对样品进行了连续洗脱，Flash制备纯化实验参数设置参见表1，样品在此条件下的Flash制备图谱如图5所示。 图5. 样品在四元元溶剂体系下的Flash分离图谱。分析图5可知，在Flash分离实验第一阶段，采用正己烷/乙酸乙酯体系作为洗脱溶剂，首先将样品中极性较弱的组分从Flash柱上洗脱下来；在第二阶段，采用二氯甲烷/甲醇体系作为洗脱溶剂，可以进一步将样品中极性较强的组分从Flash柱上洗脱下来，从而使得样品中不同极性的各组分分别得到有效分离和收集。对收集组分进行TLC点板确认，采用0.5%高锰酸钾溶液作为显色剂，利用热风枪对TLC板烘烤5min后，粗品及收集组分的显色结果如图6所示，确认各组分已得到有效分离，可以应用于下一步的研究开发中。 图6. 粗品及收集组分的TLC点板实验结果。结论对于苯并冠醚衍生物类复杂样品体系，由于其中组分极性分布范围广，常规二元溶剂体系很难对样品中各组分获得良好的分离度，利用四元溶剂系统SepaBean machine T ，对不同极性的洗脱溶剂体系进行连续在线切换，最终获得了更好的纯化效果，为此类复杂样品体系的制备纯化提供了一种便捷高效的解决方案。如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https://store.chembeango.com/。