谷氨酰胺衍生物中样品的分离纯化检测方案(制备液相色谱)

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应用文章SepaFlash@ C18AQ柱应用于谷氨酰胺衍生物类SANTATECHNOLOGIES样品的分离纯化应用技术研究中心 I关于SepaFlash@C18AQ反相分离柱系列产品 背景介绍 谷氨酰胺，即2-氨基-4-氨基甲酰基丁酸，其分子式为CHNO，分子量为 146.16 g/mol。谷氨酰胺是酸性氨基酸谷氨酸的极性且不带电荷的衍生物，它具有甲酰胺基团，其在生理pH下是中性的，可以通过水解转变为羧酸以形成谷氨酸。谷氨酰胺中的甲酰胺基团可以形成氢键。谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，意味着谷氨酰胺可以由人体自身合成，不需要从外源获取[1]。谷氨酰胺是人体内含量最丰富的氨基酸之一[2]，在人体内经由血液循环能直接穿过血脑屏障。在生物化学中，谷氨酰胺具有多种功能。除了参与蛋白质合成外，它还可以通过平衡酸碱水平从而帮助维持肝脏的pH值呈中性[3]。与葡糖糖类似，谷氨酰胺能够为细胞体提供能量[4]。它通过合成代谢反应向细胞提供氮元素[5]，并在柠檬酸循环中提供炭元素[6]。在胃肠系统中，谷氨酰胺又是小肠活动所需能量的重要来源[7]。 在抗癌药物研究中，一些癌细胞对谷氨酰胺呈现11"成瘾”效应，此效应已成为新癌症疗法的潜在靶点[8]。然而，由于谷氨酰胺对于人体内的许多基础生理过程是必不可少的，例如大脑中的突触通讯，因此，简单的从人体内去除谷氨酰胺不是可行的治疗方法并且非常危险。因此，研究人员将主要研究方向集中在与谷氨酰胺代谢途径相关的蛋白靶点上[9，10]。在临床营养学研究中，谷氨酰胺及其衍生物在创伤、感染、危重患者、骨髓移植和小肠移植等多种疾病的治疗中具有被证实的多重功效。其作用包括维持骨骼肌谷氨酰胺浓度、改善氮平衡、促进蛋白合成、避免创伤导致的肠粘膜萎缩、减轻化疗导致的肠粘膜炎、增强免疫力等[11]。因此，谷氨酰胺衍生物在临床营养学研究中日益受到研究人员的重视。 在本应用案例中，样品为极性很强的谷氨酰胺类衍生物，不易溶于正己烷、乙酸乙酯等常用正相流动相，而其在普通C18反相柱上几乎没有保留。针对样品的具体性质，三泰科技的应用工程师利用亲水性的SepaFlash@ C18AQ 柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean@machine，成功对样品进行了纯化制备，获得了满足制备需求的目标产物，为极性很强的谷氨酰胺类样品的分离纯化提供了一种可行的方案。 实验部分 本文中待纯化的样品来自某制药公司，为谷氨酰胺衍生物类物质，极性很大，其分子结构式示意图参见图1，粗品纯度约为73%(HPLC分析图谱参见图2) 【图1.谷氨酰胺衍生物类样品分子结构式示意图】 【图2.粗品的HPLC分析图谱】 取1.5g样品溶于1 mLDMSO， 超声使之完全溶解为澄清透明溶液。利用注射器将样品上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。 【表1.Flash制备纯化实验参数设置】 仪器 SepaBean° machine T 色谱柱 12 gSepaF lash*C18反相分离柱(球形硅胶，20-45pm 100 A， 订货号： SW-5222-012-SP) 120g SepaFlash*C18AQ反相分离柱(球形硅胶，20-45pm， 100A， 订货号：SW-5222-120-SP(AQ)) 检测波长 220 nm， 254nm 流动相 溶剂A：水： 溶剂B：乙腈 流速 25 mL/min 40 mL/min 进样量 300mg 1.2g 洗脱梯度 时间 (min) 溶剂B(%) 时间 (min) 溶剂B(%) 0 0 0 0 15 20 10.0 0 12.0 2.0 16.0 2.0 17.5 95 1 30.0 95 首先，我们利用一根普通C18反相柱对少量样品进行了纯化实验，样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图3所示。 [图3.样品在普通C18柱上的Flash分离图谱] 分析图3可知，样品在普通C18反相柱上几乎没有得到保留，随着样品溶剂DMSO一起直接从Flash柱上被流动相洗脱下来，因此目标产物未能与样品中的杂质有效地分离。对于这一结果，我们认为原因可以归结于固定相的疏水坍塌效应。在反相色谱中，常用的洗脱溶剂按照其洗脱强度(Elutropic strength)可以排序为：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<异丙醇。对于极性很大或亲水性很强的样品，为了确保这类样品与分离柱固定相能产生足够的保留作用，通常需要使用高比例的水相体系作为流动相，有时甚至需要用到100%的水相。在采用纯水相体系(包括纯水或纯盐溶液)作为流动相时，C18反相柱固定相上的长碳链由于疏水作用会趋向于避开纯水流动相而互相搅合到一起，导致色谱柱瞬间保留能力下降甚至毫无保留作用，此种现象称之为固定相的疏水坍塌(参加图4左边部分)。这种情况虽然可逆(可用甲醇或乙腈等有机溶剂冲洗)，但是会对色谱柱造成一定的损坏，因此需要尽量避免这种情况的发生。此外，对于大极性或强亲水性样品的分离纯化，普通C18反相柱就显得有点无能为力了。 【图4.普通C18柱和C18AQ柱硅胶表面键合相示意图】 针对上述情况，色谱填料生产厂家进行了技术改进，通过在硅胶基质表面进行一些修饰，如引入亲水的氰基(参见图4右边部分)，使硅胶表面的亲水性更强，从而防止疏水坍塌现象的发生。此类经过改性的C18柱被命名为C18AQ柱，即亲水性C18柱，专门为高水相洗脱条件设计，可以耐受100%水相体系。C18AQ柱已被广泛应用于有机酸、缩氨酸、核苷以及水溶性维生素等强极性化合物的分离纯化。 我们利用一根C18AQ柱对样品进行了的分离纯化，样品在C18AQ柱上的Flash制备图谱如图5所示。分析图5可知，谷氨酰胺衍生物类样品在C18AQ柱上获得了足够的保留作用，粗品中的其他杂质得到了有效的分离。将收集组分进行冻干处理后，经HPLC分析，所得纯化产物的纯度超过98%(参见图6)，可以用于下一步的研究开发。 【图5.样品在C18AQ柱上的Flash分离图谱】 【图6.纯化后目标产物的HPLC分析图谱】 |结论 于固定相疏水坍塌效应的影响，限制了普通C18反相柱应用于谷氨酰胺衍生物类大极性样品的分离纯化，而改进过的C18AQ柱克服了上述效应的影响，在本案例中被成功地应用于此类样品的制备纯化。因此，对于大极性谷氨酰胺衍生物类样品的分离纯化，SepaFlash@ C18AQ 反相分离柱配合 SepaBean@machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。 三泰科技推出的SepaFlash@ C18AQ反相分离柱系列产品具有多种规格(参见表2)。 【表2. SepaFlash@ C18AQ反相分离柱参数】(填料：High-efficiency spherical C18(AQ)， 20-45 pm，100A) Item Number Column Size Flow Rate MaxPressure (mL/min) (psi/bar) SW-5222-004-SP(AQ) 5.4g 5-15 400/27.5 SW-5222-012-SP(AQ) 20g 10-25 400/27.5 SW-5222-025-SP(AQ) 33g 10-25 400/27.5 SW-5222-040-SP(AQ) 48g 15-30 400/27.5 SW-5222-080-SP(AQ) 105g 25-50 350/24.0 SW-5222-120-SP(AQ) 155 g 30-60 300/20.7 SW-5222-220-SP(AQ) 300g 40-80 300/20.7 SW-5222-330-SP(AQ) 420g 40-80 250/17.2 如需进一步了解 SepaBean@machine 的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问 ( 1.Lacey， J. M.； W ilmore， D. W. ( 1 990). I s g lutamine a c o nditionallyessential amino a cid? Nutrition Reviews. 48(8)：297-309. ) ( 2.Roth， E . (2008). Nonnutritive effects of glutamine. The Journal of Nutrition. 138(10)：2025S-2031S. ) ( 3. Hall， J. E.； Guyton A. C. (2006). Textbook of medical physiology (11th ed.). St. Louis， Mo： Elsevier Saunders. p. 393. ) ( 4.Aledo， J. C. (2004) . Glutamine b reakdown in rapidly dividing cells： Waste or investment? 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Flash制备纯化实验参数设置仪器SepaBean® machine T色谱柱12 g SepaFlash® C18反相分离柱(球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-012-SP)120 g SepaFlash® C18AQ反相分离柱(球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号：SW-5222-120-SP(AQ))检测波长220 nm, 254 nm流动相溶剂A：水；溶剂B：乙腈流速25 mL/min40 mL/min进样量300 mg1.2 g洗脱梯度时间 (min)溶剂B (%)时间 (min)溶剂B (%)0000152010.00//12.02.0//16.02.0//17.595//30.095结果与讨论首先，我们利用一根普通C18反相柱对少量样品进行了纯化实验，样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图3所示。图3. 样品在普通C18柱上的Flash分离图谱。分析图3可知，样品在普通C18反相柱上几乎没有得到保留，随着样品溶剂DMSO一起直接从Flash柱上被流动相洗脱下来，因此目标产物未能与样品中的杂质有效地分离。对于这一结果，我们认为原因可以归结于固定相的疏水坍塌效应。在反相色谱中，常用的洗脱溶剂按照其洗脱强度（Elutropic strength）可以排序为：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<异丙醇。对于极性很大或亲水性很强的样品，为了确保这类样品与分离柱固定相能产生足够的保留作用，通常需要使用高比例的水相体系作为流动相，有时甚至需要用到100%的水相。在采用纯水相体系（包括纯水或纯盐溶液）作为流动相时，C18反相柱固定相上的长碳链由于疏水作用会趋向于避开纯水流动相而互相搅合到一起，导致色谱柱瞬间保留能力下降甚至毫无保留作用，此种现象称之为固定相的疏水坍塌（参加图4左边部分）。这种情况虽然可逆（可用甲醇或乙腈等有机溶剂冲洗），但是会对色谱柱造成一定的损坏，因此需要尽量避免这种情况的发生。此外，对于大极性或强亲水性样品的分离纯化，普通C18反相柱就显得有点无能为力了。 图4. 普通C18柱和C18AQ柱硅胶表面键合相示意图。针对上述情况，色谱填料生产厂家进行了技术改进，通过在硅胶基质表面进行一些修饰，如引入亲水的氰基（参见图4右边部分），使硅胶表面的亲水性更强，从而防止疏水坍塌现象的发生。此类经过改性的C18柱被命名为C18AQ柱，即亲水性C18柱，专门为高水相洗脱条件设计，可以耐受100%水相体系。C18AQ柱已被广泛应用于有机酸、缩氨酸、核苷以及水溶性维生素等强极性化合物的分离纯化。我们利用一根C18AQ柱对样品进行了的分离纯化，样品在C18AQ柱上的Flash制备图谱如图5所示。分析图5可知，谷氨酰胺衍生物类样品在C18AQ柱上获得了足够的保留作用，粗品中的其他杂质得到了有效的分离。将收集组分进行冻干处理后，经HPLC分析，所得纯化产物的纯度超过98%（参见图6），可以用于下一步的研究开发。 图5. 样品在C18AQ柱上的Flash分离图谱。图6. 纯化后目标产物的HPLC分析图谱。结论由于固定相疏水坍塌效应的影响，限制了普通C18反相柱应用于谷氨酰胺衍生物类大极性样品的分离纯化，而改进过的C18AQ柱克服了上述效应的影响，在本案例中被成功地应用于此类样品的制备纯化。因此，对于大极性谷氨酰胺衍生物类样品的分离纯化，SepaFlash® C18AQ反相分离柱配合SepaBean® machine快速液相制备色谱系统，为此类样品的快速分离纯化提供了快捷高效的解决方案。