水产品中硝基呋喃类代谢物检测方案(二手分析仪器)

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※分析检测食品科学2009， Vol. 30， No. 20332 液相色谱串联质谱法检测水产品硝基呋喃类代谢物的改进 刘四新，胡先娥1，林正峰2，何雪莲?，刘红专2，李从发1，*(1.海南大学食品学院，海南海口 570228；2.海南出入境检验检疫局技术中心，海南海口 570311) 摘 要：国标 GB/T 20752-2006测定水产品硝基呋喃类药物代谢物的实际回收率为40%左右、线性范围 0.2~2 ug/kg。 为改进不足，本实验改用乙酸乙酯提取、液液萃取净化，并适当改变 LC-MS/MS检测中液相色谱条件和质谱条件，结果显示，样品前处理时间大大缩短，方法回收率81.3%~106.0%，相对标准偏差小于11%，线性范围0.1~4.0ug/kg，相关系数 0.999以上，最低检出限0.1ug/kg。改进后的方法比国标方法在准确度、灵敏度和稳定性等方面均有所提高。 关键词：硝基呋喃类药物代谢物；液相色谱串联质谱法；水产品 Improved Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometric Method for Determination of NitrofuranMetabolites Residues in Aquatic Products LIU Si-xinl， HU Xian-e'， LIN Zheng-feng’， HE Xue-lian， LIU Hong-zhuan， LI Cong-fal* (1. College of Food Science and Technology， Hainan University， Haikou 570228， China；2. Technical Center， Hainan Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau， Haikou 570311， China) Abstract ： The Chinese national standard method， GB/T 20752-2006 has been used for the determination of nitrofuranmetabolites residues in aquatic products using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)， with a recov-ery rate of 40% and a linear range of 0.2-2 ug/kg. Extraction of test portions with ethyl acetate followed by clean-up using liquid-liquid extraction was adopted and appropriate adjustments of LC-MS/MS conditions were conducted as improvements forthe method. Results showed that the pretreatment time was shortened， and the average spike recovery rates for six replicatedeterminations were elevated to 81.3%-106.0%， with a RSD of less than 11%. This method exhibited a linear range of 0.1-4pg/kg (r>0.999) and a limit of detection of 0.1 ug/kg.Key words： nitrofuran metabolites residues； liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS /MS)； aquatic products 中图分类号： TS254.7 文献标识码： A 文章编号：1002-6630(2009)20-0331-05 我国在水产养殖中曾经大量使用硝基呋喃类抗菌药，致使出口至日本、美国等国家的水产品(如鱼、虾等)多次被检出硝基呋喃类药物超标，严重制约了我国水产品的出口。欧盟及美国FDA曾多次考察我国兽药残留监控工作，并于2006年再度考察我国水产品的养殖、加工状况以及对兽药残留监控工作的成效。在日本，已于2006年5月正式实施《食品中残留农业化学品肯定列表制度》，并执行新的残留限量标准[1]。 硝基呋喃类药物以及其代谢产物都可使实验动物发 生癌变和基因突变，并且具有生殖毒性[2]。由于其潜在的危害，欧盟将其列为A 类禁用药物B，我国也于200年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。但由于之前曾被广泛用作饲料添加剂治疗牛、猪、禽及水产品的胃肠感染，因此，硝基呋喃类药物是国际动物源性食品贸易的必检项目，为减少贸易摩擦、回避贸易壁垒，对硝基呋喃类药物残留的检测方法严格把关十分必要。呋喃类药物在动物体内能快速代谢，因而不易在动物组织中被检出，所以通过测定母体化合物的含量来 ( 收稿日期：2009-05-26 ) ( 基金项 目： “十一 五” 国家科 技 支撑计划项目(2007BAD76B06) ) ( 作者简介：刘四新(1966一)，女 ， 副教 授 ，博士，研究 方 向 为 食品生物技术。E- m ail： s ixinliu@126.com ) ( *通讯作者 ： 李从发 ( 1967一)，男，教授，博士，研究方向为应用微 生物 学。E-mail： co ngfa@vip.163.com ) 检测呋喃类药物残留是不适合的[4]。然而硝基呋喃在动物代谢过程中部分化合物可与细胞膜蛋白结合形成结合态，在相当长时间内存留在动物可食组织中不被消除，但这些结合态代谢物可以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来造成人体的危害I5]，因此，通过检测食物中硝基呋喃类药物的代谢产物更能起到监控作用。 呋喃类药物残留的分析方法主要有 HPLC、LC-MS、LC-MS/MS、分光度法、酶联免疫分析法等[4-7]，但其中有的测定成分单一，有的检测灵敏度不高，有的容易出现假阳性。在GB/T18932.24—2005中，使用LC-MS/MS 检测硝基呋喃代谢物，其检测限值是1.0ug/kg，能达到欧盟、日本、加拿大、美国等国当时水产品的监测要求，而在GB/T20752—2006中同样使用LC-MS/MS，检出限已能降低到0.5ug/kg， 可仍然满足不了出口日本的0.1 ug/kg 的检测限要求。为了提高检测效率，进一步优化检测方法，保证我国水产品顺利出口其他国家，本研究对现行GB/T20752-2006中的前处理方法进行改进，并对LC-MS/MS的操作条件进行探索，使得检测的时效性大大提高，而且准确度、灵敏度和稳定性也相应提高。 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 样品 冻罗非鱼片、金鲳鱼片、章雄鱼苗、冷冻寿司虾、南美白对虾、冻罗非鱼、面包虾、黄鱼，由海南省内多家水产品加工企业送检提供。 1.1.2 试剂 甲醇、乙酸乙酯(色谱纯) 美国 Waters 公司；；甲酸、冰醋酸(色谱纯) Fisher Chemicals 公司；2-硝基苯甲醛(2-NBA，衍生化试剂)、乙酸铵、四氯化碳、二甲亚砜、磷酸氢二钾等均为国产分析纯试剂。 硝基呋喃类药物代谢物标准品为德国DR公司生产，包括呋喃西林代谢物氨基脲(semicarbazide，SEM)、呋喃南酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidone，AOZ)、呋喃妥因代谢物1-氨基海特因(1-aminohydantoin， AHD)和呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidone， AMOZ)；两种硝基呋喃的内标物(AMOZ-D5、AOZ-D4) 德国 Witega 公司。 四种标准品及其内标物储备溶液、标准溶液的配制：按照GB/T20752—2006 进行。 1.2 仪器与设备本研究使用的仪器与设备是根据出口国的要求而配 置的。 Agilent1100 液相色谱仪 美国Agilent 公司；API3000液相色谱串联质谱仪美国应用生物系统公司；回旋式恒温气浴振荡仪 汇江苏教育玻塑厂；冷冻离心机德国 Hettich 公司；蜗旋仪 德国IKA公司；微量移液器 美国 Dragon-med公司；超声波清洗器 美国Branson 公司；定量器 德国Brand公司；氮气吹干仪北京八方世纪有限公司。 1.3 方法 1.3.1 样品前处理方法 1.3.1.1 混合基质标准溶液的制备 参照 GB/T 207522006进行，所做的改进详见表1。 表1 混合基质标准校正液的配制方法 Table 1 Improved preparation method for mixed substratestandard correction solution 步骤 国标中的方法 本实验改进的方法 样品称取量 称样量为2g 称样量为5g 水解和衍生化 加酸后均质1 min， 不均质而充分混匀， 加衍生剂0.3ml 加衍生剂0.1ml乙酸 净化 HLB固相萃取柱提取， 乙酯液液萃取，吹 乙腈洗脱，吹干需2h乙 干需20min 甲醇：水 定容试剂 腈：乙酸(10：0.3) (1：1) 样品称取及准备：称取5个阴性样品各5g(精确到0.001g)，分别置于40ml离心管中，加入10ml甲醇水混合溶液(2：1)[9]，均质1min， 再用5ml甲醇-水合溶液洗涤均质器刀头，二者合并后于4000r/min离心10min，弃上清液。向每个离心管中分别加入适量10.0ng/ml 的四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，使其最终测定浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、10.0ng/ml。再加入入量 10.0ng/ml 的混合内标标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终浓度为2.0ng/ml。 1.3.1.2 待测样品溶液的制备 称取待测样品5g(精确到0.001g)，置于40ml离心管中，加入10ml甲醇-水混合溶液(2：1， V/V)I， 均质1min，再用5ml甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并后于4000r/min 离心10min， 弃上清液。再向离心管中加入10.0ng/ml 混合内标标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终测定浓度为 2.0ng/ml。其余按表1的步骤进行衍生、净化和定容。 1.3.1.3 阴性样品基质空白溶液的制备 称取阴性样品5g(精确到0.001g)， 置于40ml离心管中，加入10ml甲醇-水混合溶液(2：1，V/V)D， 均质1min，再用5ml甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并后于4000r/min 离心10min，弃上清液。其余按照表1步骤进行。 1.3.2 液相色谱条件 根据前处理方法的特点， LC-MS/MS 中的液相色谱条件做了相应改变，定容溶液与流动相要保持一致，详见表2。 表2 液相色谱条件 Table 2 Liquid chromatography conditions 液相色谱条件 国标中的条件 本实验条件 色谱柱 Atlantis-C18 Agilent Extend-C1s (150mm ×2.1mm， 3.5pm) (150mm× 2.1mm， 5pm) 柱温 35℃ 25℃ 流动相0.3%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱 0.5mmol/L乙酸铵与甲醇梯度洗脱 流速进 样量 200p1/min 800p1/min 40p1 100p1 1.3.3 质谱条件 四种硝基呋喃代谢物的性质虽然相似，但仍然存在差异，其碰撞室出口电压(CXP)和去簇电压(DP)都不尽相同，详见表3、4。 表3 质谱条件 Table 3 MS conditions 质谱条件 国标中的条件图 本实验条件 仪器型号 API3000电喷雾离 API3000电喷雾离 离子源扫描方 子源(ESI)正离子扫 子源(ESI)正离子扫 式检测方式 描多反应检测 描多反应检测 电喷雾电压(V) (MRM) (MRM) 5000 4500 碰撞室出口电压(V) 11 SEM： 13/14；AHD：14/11： AOZ： 43/58； AMOZ：73/66 SEM： 57/69； AHD：57/61： AOZ： 43/58； AMOZ： 73/65 去簇电压(V) 45 表4 离子对信息 Table 4 Ion coupling information 衍生后的硝基呋喃 定性离子对 定量离子对采集时间 代谢物及内标物名称 (m/z) (m/z) (ms) 2-NP-AMOZ 335.1/262.1 335.1/291.1 335.1/291.1 100 2-NP-SEM 209.1/192.1 209.1/166.1 209.1/166.1 150 2-NP-AHD 249.1/134.1 249.1/178.1 249.1/134.1 200 2-NP-AOZ 236.1/104.1 236.1/134.1 236.1/134.1 100 2-NP-D5-AMOZ 340.1/296 340.1/296 100 2-NP-D4-AOZ 240.1/134.1 240.1/134.1 100 1.3.4 液相色谱串联质谱测定 利用LC-MS/MS 的定性、定量测定方法、回收率实验方法和结果计算方法等均参照GB/T20752—2006进行。 2 结果与分析 2.1 前处理方法的改进 试样中有机物在酸性条件下水解，将其中残留的结 合态硝基呋喃代谢物游离出来。利用2-硝基苯甲醛进行衍生，调pH7.4后以乙酸乙酯提取、正己烷净化，采用液相色谱-串联质谱法定性检测，稳定同位素内标法进行定量测定。 称样量：实践经验表明，称样量太少，均质过程中样品损失率较大，从而影响测定精度和回收率。事实上，按照 GB/T 20752-2006的2g称样量操作，达不到方法中所提供的线性范围；反之，称样量太大，操作繁琐而基质干扰大。通过探索，本研究使用5g称样量较合适。 水解和衍生生条件：国标方法中加入 0.3ml 衍生济后高速混匀、避光反应16h。实践表明，衍生剂加入过多会导致反应副产物多，对图谱的基质干扰较大。通过摸索，发现加入0.1ml衍生剂比较适宜。由于混匀器使用的转速一般在2000r/min 以上，无法准确控制衍生化反应时间，本研究采用充分摇散加入的样品使不结块为宜，故各次测定的衍生条件基本一致，重复性较好。 提取方法：国标中采用固相萃取进行提取，操作较为繁琐，并且重现性、稳定性较差，效率低，成本也较高。本研究采用乙酸乙酯液液萃取，适用于大多数复合型基质，对不同极性的被测物有较高的回收率，操作简单，结果稳定，且易挥易(约20min)， 毒性小，成本低廉。而用乙腈提取所需吹干时间长(约2h)，毒性也大。此外，固相萃取对畜肉、禽肉等动物组织具有较好的提取净化效果，但对黏稠的、胶体状复杂样品如鱼、虾、蟹和贝类样品，则易堵塞、不宜洗脱、操作繁琐、成本较高。 2.2 仪器线性范围和检出限的测定取不含硝基呋喃代谢物的冷冻罗非鱼肉样品 5.00g， 分别加适量4种硝基呋喃代谢物的系列标准溶液，按照与样品相同的衍生和提取步骤处理，制得0.5、1.0、2.0、4.0、10和 20ng/ml 的一系列标准溶液， 经LC-MS/MS分析，分别以硝基呋喃代谢物浓度为横坐标，以各特征离子质量色谱峰面积与相应内标的峰面积比为纵坐标[10]，绘制校正曲线、计算回归方程和相关系数，结果见表5. 表5 线性范围 Table 5 Linear range and limit of AOZ， AMOZ， AHD and SEMdetermined by this method 代谢物 线性方程 相关系数r 线性范围(ng/ml) 检出限(ng/ml) AOZ Y=0.0586X 0.9998 0.1~~4 AMOZ Y=0.193X 0.9999 0.1~4 AHD Y=0.0845X 0.9998 0.1~4 SEM YY=0.152X 0.9999 0.1~4 由表5可知，线性方程的相关系数都达到0.999 水平，说明仪器的稳定性较好；线性范围为 0.1~4ug/kg， 而在GB/T20752-2006中线性范围只有0.2~2ug/kgll，说明在这种仪器操作条件下测得的结果准确度较高，可信度较大；仪器的检出限较低，说明检测灵敏度有所提高。 2.3 方法的回收率测定取不含硝基呋喃代谢物的冷冻罗非鱼肉样品 5.00g， 分别做4种硝基呋喃代谢物1.0ug/kg 和10.0ug/kg 的添加，每水平各做6份平行，按照样品的操作过程进行提取、净化和测定。结果见表6. 表6 回收率和精密度(n=6) Table 6Average spike recoveries of AOZ， AMOZ， AHD and SEMin tilapia meat (n = 6) 代谢物 添加水平(ug/kg) 平均测量值(ug/kg) 平均回收率(%) 相对标准偏差(%) AOZ 1.0 0.834 83.4 7.2 10 9.313 93.1 10.4 AMOZ 1.0 0.940 94.0 6.5 10 8.13 81.3 8.4 AHD 0.1 0.860 86.0 9.1 10 10.1 101.0 7.7 SEM 0.1 1.06 106.0 11.0 10 9.75 97.5 9.2 按照国标方法进行操作时，实际回收率最低只有40%左右，显然不符合分析要求。由表6可知，经改进后的方法对4种硝基呋喃类代谢物的回收率在81.3%~106.0%之间，相对标准偏小于11%。 2.4 样品测定 对海南省各大水产加工企业送检的8份样品(包括冻罗非鱼片、金鲳鱼片、章雄鱼苗、冷冻寿司虾、南美白对虾、冻罗非鱼、面包虾、黄鱼)进行检测，结果显示冻罗非鱼片和金鲳鱼片检测到有呋喃西林代谢物存在，其余样品均未检出有硝基呋喃类代谢物存在。其中冻罗非鱼片中含呋喃西林代谢物 3.87ug/kg， 金鲳鱼片中含0.116ug/kg。 2 4 5 6 7 8 9)110时间(min) 图1 呋喃西林标准品的MRM色谱图 Fig.1 MRM chromatogram of SEM standard 图2 冻罗非鱼片样品中中喃西林的 MRM色谱图 Fig.2MRM chromatogram of SEM in frozen tilapia samples 冻罗非鱼片中含有呋喃西林代谢物也可以从该样品的多反应监测(MRM)色谱图(图2)中定性地判断出。209.1/192.0 离子对是呋喃西林的一对定性离子对，在加标样品中该离子对保留时间 6.03min， 定性离子对与定量离子对响应强度的比值是0.65(图1)。该离子对在冻罗非鱼片样品中保留时间为 6.04min， 定性离子对与定量离子对响应强度比为0.63，保留时间偏差约0.16%，小于规定的2.5%；同时，相对离子丰度大于50%， 其偏差为3%，也符合小于20%的规定，因此可以判断冻罗非鱼片样品中含有呋喃西林代谢物。 3 结 论 对 GB/T 20752—2006 中水产品硝基呋喃类药物代谢 物的LC-MS/MS检测的样品前处理方法进行了改进，并适当调整了液相色谱和质谱的操作条件。改进后方法的回收率81.3%~106.0%，相对标准差差小于11%，线性范围0.1~4.0ug/kg，相关系数0.999以上，最低检出限0.1ug/kg。改进后的方法比国标方法在准确度、灵敏 ( 参考文献： ) ( [1] 董琳琳." 日 本 肯 定列表 " 对我国水产 品 出口的 影 响[].动物保健， 2006(6)：38-39. ) ( [2] 宋 阳 威. 呋 喃类药物检验检疫现 状及对 策[].中国 动物 检 疫 ，2 0 03， 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