基于超微量紫外扫描与生物效应检测鉴别佛手、香圆和枸橼

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目的：通过超微量紫外扫描与体外生物效应对佛手、香圆、枸橼进行鉴别。方法：通过光学显微镜观察3种药材的粉末，采用超微量紫外扫描获得佛手、香圆、枸橼提取物的最大吸收波长，通过酶标仪检测药材提取物的DPPH自由基清除、乙酰胆碱酯酶抑制和α - 葡萄糖苷酶抑制活性。结果：佛手、香圆、枸橼粉末的显微特征无明显区别，其紫外最大吸收波长分别为323、285、270 nm，三者均无明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性，但均有显著的α - 葡萄糖苷酶抑制活性，其中DPPH自由基清除活性可用于香圆与枸橼的区分。结论：超微量紫外扫描结合体外生物效应检测是鉴别佛手、香圆、枸橼的有效方法，且3种药材含有潜在的DPPH自由基清除剂与α - 葡萄糖苷酶抑制剂。中药鉴定发展趋势是简便微量化和生物效应鉴定。简便性是中药鉴定的基本要求，采用更少的试剂符合环境友好的原则，当前基于紫外光谱的微型化鉴定方法发展迅速，该技术利用中药提取物的紫外光谱特征进行快速、无损的鉴定，极大提高了中药鉴定的效率和准确性，降低了中药鉴定的成本。传统的性状、显微、理化鉴定均与药材的生物活性不直接相关。目前，《中华人民共和国药典》和国家药品监督管理局均提出了中药生物效应鉴定指导原则。国内学者也呼吁要增加中药材的生物效应指标。然而，中药的成分复杂、药理作用机制不明确，给生物效应鉴定带来了一定的困难，绝大多数中药缺乏个体化的生物效应鉴定方法。尽管面临着诸多挑战，但发展中药生物效应鉴定仍是必然趋势。佛手、香圆、枸橼均来源于芸香科、柑橘属，三种植物的果实均可药用。其中，香圆、枸橼的干燥成熟果实为药材香橼的来源。佛手、香圆、枸橼功效相似，均可疏肝理气、化痰。传统的性状鉴定可用于佛手的辨识，但不易区分性状特征相似的香圆和枸橼。由于三种药材亲缘关系相近，其显微特征存在相似性。此外，三种药材均含有橙皮苷、柚皮苷等黄酮类成分，传统的理化鉴定难以实现三者的区分。因此，有必要发展新型有效的鉴别方法用于区别佛手、香圆、枸橼。本研究以同科同属的佛手、香圆、枸橼为研究对象，探索超微量紫外扫描与生物效应检测相结合的中药鉴定方法。该鉴定方法符合简便微量化且体现生物效应发展趋势，可为其他亲缘关系相近的中药鉴别提供参考，对于发展新型中药鉴定策略具有积极意义。仪器与试剂BIOBASE - EL 10B型酶标仪；UL - 5000型超微量紫外分光光度计（上海美析仪器有限公司，型号：UL - 5000）；F - 010S型超声波清洗器（深圳市钰洁清洗设备有限公司，型号：F - 010S）；力辰 101 型烘箱、力辰 LC -Vortex - P2 型点动混匀仪、FA1004 型电子分析天平（上海力辰仪器科技有限公司，型号：FA1004）。佛手、香圆、枸橼果实（批号：2021113001，浙江金华、江苏镇江、云南大理）；1，1 - 二苯基 - 2 - 苦基肼、碘化乙酰硫代胆碱、5，5'- 二硫代双（2-硝基苯甲酸）［批号：C10636623、H1803032、E1922062，阿拉丁试剂（上海）有限公司］；4 - 硝基苯基 - α - D - 吡喃葡萄糖苷、乙酰胆碱酯酶（批号：J29GS156009、Y23O11Q128361，上海源叶生物科技有限公司）；α - 葡萄糖苷酶（批号：20200525001，上海鼓臣生物技术有限公司）。实验方法样品溶液的制备：分别称取佛手、香圆、枸橼粉末0. 1 g，精密称定，置于离心管中，加甲醇10 mL，超声提取30 min，摇匀，采用针式过滤器过滤，即得。粉末显微鉴定：取佛手、香圆、枸橼粉末少量，置于载玻片上，滴加饱和水合氯醛2滴，酒精灯加热至透化，滴加稀甘油2滴，加盖玻片置于光学显微镜下观察。超微量紫外扫描：启动超微量紫外分光光度计，用移液枪吸5 μL水清洗3次，再吸1 μL甲醇作为空白对照。分别吸取1 μL佛手、香圆、枸橼提取物进行检测，确定最大吸收波长。体外生物活性检测：DPPH自由基清除活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性、α - 葡萄糖苷酶抑制活性的步骤以及阳性对照参考本研究组研究成果。DPPH自由基清除活性：分别取佛手、香橼、枸橼溶液300μL于不同离心管中作为第1个浓度点，再取300μL溶液于300μL甲醇中作为第2个浓度点，依次对半稀释作为梯度浓度。样品孔先滴加50μL样品，再滴加150 μL DPPH溶液，每个浓度设 4 个复孔。空白孔加入 50 μL 甲醇、150 μL DPPH 溶液，进板分析。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理 。乙酰胆碱酯酶活性：配制梯度浓度的佛手、香橼、枸橼溶液作为样品。每孔加110μLPBS溶液（pH值8），再滴加20 μL样品，每个浓度设4个复孔。对照组加入110 μL PBS（pH值8）、20 μL空白溶液。用排枪滴加20 μL的酶液（0. 3 U/mL），孵育5 min后使用排枪50 μL碘化乙酰硫代胆碱与5，5' - 二硫代双（2 - 硝基苯甲酸）的混合溶液，进板分析，在405 nm下读取吸光度，每个样品板共计20 min。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理。α - 葡萄糖苷酶抑制活性：向样品孔滴加30 μL样品，然后滴加30 μL α - 葡萄糖苷酶溶液（0. 8 U/mL），每个浓度设4个复孔。空白对照加入30μL溶剂、30 μL酶溶液。孵育30 min后用排枪加入90μLPNPG溶液，进板分析。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理。结果外观鉴定：佛手外观形似手指，成熟果实表面黄色；香圆与枸橼的形状均为类圆形或椭圆形，成熟果实表面黄色，未成熟部分为绿色。显微鉴定：三种药材的粉末显微特征。佛手、香圆、枸橼的导管均成束且多为螺纹导管，中果皮薄壁组织为不规则的多边形，边缘不均匀增厚。整体而言，佛手、香圆、枸橼的粉末显微特征相似，不易区分。紫外最大吸收波长鉴定：佛手、香圆、枸橼提取物的超微量紫外波长扫描图。三种药材的最大吸收波长分别为 323、285、270 nm，最大吸收波长具有显著差异。因此，可通过最大吸收波长区分佛手、香圆、枸橼。而且，超微量紫外扫描法操作简单，所需要的样品量为微升级别，符合中药鉴定简便微型化的要求。体外生物活性鉴定：佛手、香圆、枸橼提取物的 DPPH 自由基清除活性、乙酰胆碱酯酶的抑制活性、α - 葡萄糖苷酶抑制活性。佛手、香圆的自由基清除率超过了50%，其IC 50 值分别为1. 56、1.93 mg/mL，枸橼的DPPH自由基清除活性低于佛手、香圆。考虑到香圆和枸橼具有相似的性状特征，DPPH自由基清除活性可用于二者的区分。3种药材均无明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性。佛手、香圆、枸橼均有较强的 α - 葡萄糖苷酶抑制活性，其IC 50 值分别为0. 10、0. 12、0. 09 mg/mL，表明3种药材中含有潜在的α - 葡萄糖苷酶抑制剂。讨论佛手、香圆、枸橼具有很多共性特征：三者亲缘关系接近，均来源于芸香科柑橘属；三者功效相近，均可疏肝理气、化痰；三者的主要成分均为黄酮类。除了药用，佛手、香圆、枸橼还常用作保健茶，具有较大的市场需求量。在商品规格中，3种药材常切丝用，由于三者在多个方面存在共性特征，这为药材鉴别带来了一定的挑战。针对该问题，本研究采用传统的显微鉴定方法发现，3种药材均具有相似的导管、中果皮薄壁组织，结果显示三者难以区分。基于此种情况，本文提出一种超微量紫外扫描结合体外生物效应检测的整合策略，以实现亲缘关系相近中药的准确鉴别。结果显示，3种药材的提取物在最大吸收波长处具有明显区别。在体外生物活性检测方面，3种药材在自由基清除方面具有差异，可用于区分外观相似的枸橼与香圆。此外，3种药材均具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，表明药材中可能含有抑制α - 葡萄糖苷酶的先导化合物。佛手、香圆、枸橼用作保健茶可能与其潜在的降糖作用有关。结论超微量紫外扫描结合体外生物效应检测是鉴别佛手、香圆、枸橼的有效方法。该方法符合当前中药鉴定简便微量化、体现生物效应的发展趋势。3种药材含有潜在的自由基清除剂与α - 葡萄糖苷酶抑制剂，可为后续先导化合物的发现奠定前期基础。