离子色谱直接电导法同时测定常见氨基酸和无机阳离子

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离子色谱-直接电导法同时测定常见氨基酸和无机阳离子 焦扬1.2，杨鹏波2*，李春1.3，丛威² (1.石河子大学食品学院，新疆，石河子832000；2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190；3.北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081) 摘要：建立了阳离子交换色谱-直接电导法测定部分常见氨基酸和无机阳离子的方法.以酒石酸和吡啶二羧酸溶液为淋洗液利用阳离子色谱系统等度洗脱，通过对色谱分析条件的优化，无需衍生化即可同时测定谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe) 和赖氨酸 (Lys) 及无机阳离子 Nat、NH、K*、Ca²和 Mg，并简述了其分离机理.实验中选择12 min 内出峰的5种氨基酸和3种无机阳离子进行了定量分析研究.结果表明，其相对标准偏差(RSDs，n=5)不大于4.690%；标准曲线的线性相关系数(R²)不低于 0.9984；检出限(20pL进样，S/N=3) 在 0.27~10.34 mg/L 之间；采用建立的方法对味精等电母液中的氨基酸进行了测定，结果显示，所分离氨基酸的回收率在88.7%~107.2%之间. 关键词：离子色谱，直接电导检测器，氨基酸，无机阳离子 中图分类号：O658；TS207 1.前言 氨基酸是一种重要的生命物质，是生物体内许多重要的生化反应的参与者，并且是组成蛋白质的基础物质，是生命延续过程必须摄取的成分，也是生物化学、生化制药、生物工程中的重要研究对象".因此涉及它们的分离、分析问题也日益受到人们的关注，开发简便易行的氨基酸的分析方法显得尤为重要. 早期的氨基酸分析方法一般采用经典的氨基酸分析仪，混合氨基酸经阳离子交换色谱柱分离后，使用 柱后衍生法衍生，然后采用可见光检测器测定.但氨基酸分析仪只能用于分析氨基酸，且价格昂贵，分析时间相对较长，由此限制了该氨基酸分析技术的广泛应用.目前较常用的方法是高效液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography， HPLC)， 但大多数氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收，所以需要进行化学衍生使其具有相应波长的光吸收. HPLC 对氨基酸测定过程中的衍生化分为柱前衍生化和柱后衍生化两种，常有的柱前衍生剂有2，4-二硝基氟苯 (dinitrofluorobenzene， DNFB)、邻苯二甲醛，(o-phthalaldehyde， OPA)、二甲氨基萘磺酰氯 (Dansyl-Cl) 和异硫氰酸苯酯 (phenyl isothiocyanate， PITC)等，衍生化后可使用反相色谱柱进行分离，采用紫外或荧光检测器即可定量测定[2-5].柱后衍生法需要首先利用离子交换色谱柱将氨基酸分离，然后采用衍生剂邻苯二甲醛(OPA)或茚三酮衍生后，即可采用相应的检测器测定161.但是衍生化的方法也有一定的不足之处，如：衍生产物的稳定性不够，容易受到其它物质的干扰，而且衍生剂一般是剧毒物质，衍生过程也延长了样品的测定时间. .近年来，出现了氨基酸的直接分析技术，其原理是先利用离子交换把待测样品中的混合氨基酸分离，然后使用电化学检测器或电导检测器进行测定8].电化学检测器有安培检测器、积分脉冲安培检测器等，具有灵敏、准确、线性范围宽等优点；但是使用过程中，氧化产物容易吸附在电极的表面，使其钝化；另外，一些具有还原性的物质(如样品中葡萄糖等)也可能对氨基酸的测定产生干扰[9-11].此外，蒸发光散射检测器 (Evaporative Light-Scattering Detector， ELSD)、电导检测器 (Conductivity Detector， CD) 和核磁共振等用于氨基酸的检测也有相关的研究[121. Zhang 等[13-15]研究了低压离子色谱-电导检测器测定常见氨基酸中的10种氨基酸的技术，其最大的优点是简单、快速. 虽然采用电导检测器直接测定氨基酸已有研究，但是氨基酸与无机阳离子同时分析的文献尚未见报道.本文采用阳离子交换色谱系统，利用直接电导检测器同时测定样品中的部分常见氨基酸和无机阳离子，并对其进行了定量分析. 2.实验 2.1试剂与容液 L-(+)-酒石酸(优级纯)、吡啶-2，6-二羧酸(GR)和谷氨酸 (glutaminacid， Glu) 生化试剂， BR， ( 基金项目：中 国 科学院知识创新工程重要方向项目(编号： KSCXZ-Y W -G-020)， 863重点项目(编号： 2 006AA020301) ) ( 作者简介：焦扬(1973一 ) ， 女 ，甘肃省景泰县人，讲师，硕士研究生，生物化工专业；杨鹏波，通讯联系人， Tel： 010- 62554284， E -mail： pbyang@home.ipe.ac.cn. ) 购于国药集团化学试剂有限公司；丝氨酸(serine， Ser)、半胱氨酸 (cysteine， Cys)、苏氨酸 (threonine，Thr)、甘氨酸 (glycine， Gly)、丙氨酸 (alanine， Ala)、酪氨酸 (tyrosine， Tyr)、氨酸 (valine， Val)、甲硫氨酸 (metionine， Met)、亮氨酸 (leucine，Leu)、异亮氨酸 (isoleucine， Ile)、苯丙氨酸 (phenylalanine，Phe)、赖氨酸 (lysine， Lys) 和组氨酸 (histidine， His) 购于北京欣经科生物技术有限公司；氯化钠等无机盐(分析纯，AR) 购于北京化工厂. 氨基酸和无机阳离子储备液的配制：采用电子天平准确称取各种氨基酸和无机阳离子的相应硫酸盐或盐酸盐(以氨基酸或相应的无机阳离子为准)，配置成浓度为 1000 mg/L 的测定用储备液待用。实验所使用的各浓度标准液均由储备液稀释而成。味精等电母液由梅花味精集团有限公司提供.实验中所使用的超纯水(大于18MQ)由厦门锐思捷科学仪器有限公司的纯水系统生产. 2.2仪器与设备 761型离子色谱仪(Metrohm，瑞士)：配置有单元泵，电导检测器，自动进样阀，20 L 定量环， MetrosepC 2 150/4.0阳离子色谱分析柱，使用万通色谱软件 IC Net 控制仪器及进行数据采集； AB104-N 电子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)； -次性0.22 um针式过滤器(美瑞泰克科技有限公司). 2.3色谱条件 分析柱： Metrosep C 2 150/4.0阳离子色析分析柱；保护柱： Metrosep RP Guard；检测器：电导检测器，双钢环电极，电导导体积为1.5uL；淋洗液条件：酒石酸和吡啶二羧酸的混合溶液；淋洗液流量：0.5或1.0 mL/min； 进样方式：：自动阀切换进样；进样体积：20uL；测定温度：室温. 3.结果与讨论 3.1常规淋洗液条件下各离子的保留时间 在色谱柱推荐的条件下，使用淋洗液：4.0 mmol/L 酒石酸+1.0 mmol/L 吡啶二羧酸溶液，流速为1.0mL/min，分别考察了常见多种氨基酸和无机阳离子的保留时间.实验结果见表1. 表1常规淋洗液下各氨基酸和无机阳离子的保留时间 Table 1 The retention time of amino acids and inorganic cations lon Retention time (min) Ion Retention time (min) Glu 2.41 Ile 4.73 cys 2.46 Na 5.22 2.55 Phe 5.84 Thr 2.59 NH4 5.86 Gly 2.87 K* 8.02 2.99 Ca²+ 11.61 3.66 Lys 13.15 3.66 His 13.43 Met 3.96 Mg 17.76 Leu 4.68 由表1可见， ① Glu， Cys， Thr， Ser； ② Ala， Gly； ③ Met， Tyr， Val； ④ Leu， Ile， Na； ⑤ Phe， NH4； ⑥ Lys，His 共六组氨基酸和无机阳离子，由于其保留时间较为接近，采用常规色谱分离条件难以分离，需要进行色谱条件的优化. 3.2淋洗液的优化及氨基酸和无机阳离子同时分析探索 3.2.1流速的影响 选择第③组中的 Tyr 和 Met为分离考察对象，在淋洗液为3.0 mmol/L 酒石酸+2%乙腈(V：V)条件下：分别考察了淋洗液流量为 0.5 mL/min 和 1.0 mL/min 对这两种氨基酸的分离度的影响. 分离度 Rs 是表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度，是两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值之比.分离度Rs可用(1)式计算得到16]： 式中 t 和tz分别表示两个洗脱峰的保留时间，W(/2)1和W(1/2)2分别表示两个洗脱峰的半峰宽.由实验可得，在淋洗液流量为 0.5 mL/min 条件下， Rs (Tyr 和Met) 为0.430，而在1.0 mL/min 条件下Rs (Tyr和Met) 为 0.415.由此可知，在小流量下有助于其分离度的提高，但是仍然不能实现较好的分离 3.2.2有机溶剂的影响 同样选择 Tyr 和 Met 为分离对象，分别考察了淋洗液Ⅰ(3.0 mmol/L酒石酸溶液)和淋洗液Ⅱ(3.0 mmol/L酒石酸+2%乙腈，.V：V)，在流速为 0.5 mL/min 条件下对这两种氨基酸分离度的影响.实验结果表明，加入乙腈后各氨基酸的保留时间均有所缩短， Tyr 缩 Met 的保留时间分别由 7.46 min 和 7.85 min 变为 7.27 min和7.01 min. 在淋洗液Ⅰ的条件下， Rs (Tyr 和 Met)为 0.536， 而在淋洗液Ⅱ的条件下其分离度为0.430.由此可见，有机溶剂乙腈的加入对 Tyr 和 Met的分离没有明显的作用. 3.2.3淋洗液中酒石酸和吡啶二羧酸浓度的影响 根据表1中的数据，选择 Phe 和 NH4*、Leu 和 Na 及 Met 和Tyr 三组在常规色谱条件下难以分离的离子为考察对象，采用常规淋洗液 a(4.0 mmol/L 酒石酸+1.0 mmol/L 吡啶二羧酸溶液)和淋洗液Ⅰ(3.0 mmol/L酒石酸溶液)，设置流量为 1.0mL/min， 研究了淋洗液浓度对氨基酸和无机阳离子分离度的影响.根据测定结果计算所得的各组离子的分离度见表2. 表2淋洗液浓度对各组离子分离度的影响 . Table 2 Effect of concentration of eluent on the separation of amino acids and inorganic cations Rs Eluent a Eluent I Rs(Phe and NH) 0.05 4.58 Rs(Leu and Na) 0.87 5.65 Rs(Met and Tyr) 0.78 0.63 由表2中的数据可知，改变淋洗液的浓度，采用淋洗液Ⅰ后，氨基酸和无机阳离子的分离度明显增大，由此，两者可达到有效分离，如 Phe 和 NH*的分离，但对两种氨基酸的分离没有较明显的作用，如 Met和 Tyr. 3.2.4部分常见氨基酸和无机阳离子同时测定条件的确定 根据上述实验结果，选择能够通过改变淋洗液浓度进行分离的几种物质进行同时测定实验，所选择的氨基酸分别是 Glu、Ala、Met、Leu、 Phe 和Lys 6种；选择的无机阳离子分别是 Na*、NH4*、K*、Ca²和Mg5种.实验共选择了7个浓度的淋洗液对这11种物质进行分离.淋洗液的配比和结果的简单说明见表3.由表3的结果可知，淋洗液的最佳浓度为：酒石酸1.3 mmol/L， 吡啶二羧酸 1.1 mmol/L，基本可以实现 11中物质离子的分离，在此条件下的色谱图如图1所示.所以下面的定量分析选择该浓度的淋洗进行测定. 表3不同浓度的淋洗液条件下部分氨基酸和无机阳离子的分离结果 Table 3 The brief description of results under different eluent concentration Concentration (mmol/L) The number of L-(+)-Tartaric Pyridine-2，6- The brief description of results eluents acid dicarboxylic acid 3.5 1.0 The peak of Phe was immerged in the peaks of Na and NH4. 2 3.0 0.5 The peaks of Phe and Na largely overlap. 3 2.5 1.0 The peaks of Phe and Na completely overlap 4 2.0 1.0 The peaks of Phe and Na largely overlap； The peaks of Caand Lys largely overlap. 5 1.5 1.1 The peaks of Phe and Na partly overlap. 6 1.3 1.1 Completely separated. 7 1.4 1.1 The peaks of Phe and Na partly overlap. 由表3可知，淋洗液的最佳浓度为：酒石酸1.3mmol/L+吡啶二羧酸 1.1 mmol/L， 基本可以实现11种物质离子的分离，在此条件下的色谱图如图1所示..由此，以下的定量分析均选择该浓度的淋洗液进行了结果测定. 3.3分离机理的简单分析 离子色谱的选择性与被测离子与色谱柱固定相的功能基团之间的相互作用力密切相关，这些作用力主要有静电作用、疏水作用和氢键等17.由此我们认为，在氨基酸与无机阳离子采用阳离子色谱系统进行同时测定过程中，静电作用是影响各离子出峰顺序的主要因素，分析如下： 首先，氨基酸所处的溶液的 pH 与其等电点相差越大，其所带的电荷量就越多.用于分离部分常见氨基酸和无机阳离子的淋洗液的 pH 约为3.10，因此在该条件下氨基酸的保留时间顺序应为：酸性氨基酸<中性氨基酸<碱性氨基酸；其次， "i中性氨基酸(Ala、Met、Leu 和 Phe)可视为一元弱碱，同理碱性氨基酸(Lys )可作作二元弱碱，它们在溶液中是不完全解离的，因此在同等条件牛，与一元、元无机强碱相比，带电量较少[18]，与色谱柱固定相之间的静电作用力较弱.加之，碱性氨基酸(Lys)由于其弱碱性，在淋洗液条件下不完全解离，因此分子平均带有电荷量应介于1和2之间.综合以上原因，氨基酸和无机阳离子总体的保留时间顺序应为： 图1部分常见氨基酸和无机阳离子的色谱图 Fig.1 The chromatogram of amino acids and inorganic cations.Chromatographic conditions： IC column： Metrosep C 2 150/4.0；sample： mixed standard solution of six amino acids and fiveinicorganic ccaations； eluent： the solution of 11..33mmol/LL-(+)-Tartaric acid and 1.1 mmol/L Pyridine-2，6-dicarboxylicacid； flow-rate： 1.0 ml/L； sample injection volume： 20 pL. 酸性氨基酸(Glu)<中性氨基酸(Ala、Met、 Leu 和 Phe)<单价无机阳离子(Na*、NH4*和K)<碱性氨基酸(Lys)<二价无机阳离子(Ca和Mg). 另外，对于无机阳离子来说，电荷数相同时，离子半径越小，则水合半径就越大，，与色谱柱固定相上的带负电基团的作用力就越小，其保留时间就会越短，因此单价无机阳离子的出峰顺序为Na、NH4和K；再者，由于淋洗液中含有吡啶二羧酸，能够与 Ca²+形成螯合物，螯合物的半径要比游离的 Ca²+大，所以 Ca?+先于 Lys 和Mg出峰.同样，我们可以把这一规律用于4种中性氨基酸(Ala、Met、 Leu 和 Phe)出峰顺序的分析.从结构上来说，实验中的4种中性氨基酸所不同的就是R侧链， Ala、Met、Leu 和 Phe 的R侧链的大小顺序分别是甲基<甲硫基乙基<异丁基<苯甲基苯19，由此可以推断其保留时间的顺序应为： Ala 关闭