水产品中氯霉素类药物残留检测方案

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超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定水产品中氯霉素类药物残留 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8030 联用测定水产品中测定氯霉素类药物残留的方法。借助超高效液相色谱 LC-30A 在 2.5 min 内实现快速分离，三重四极杆质谱仪 LCMS-8030 进行定量分析，因此可以快速、准确地测定甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素。这3种物质的线性良好，相关系数均大于0.999；不同浓度的精密度实验结果表明：其保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.13~0.54%和1.68~4.31%之间，仪器精密度良好；E甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素的检出限分别为0.10、0.04和0.04 ug/L， 定量限分别为 0.41、0.17和0.15 ug/L；样品加标回收率为 81.5~105.5%。 关键词：兽药残留水产品氯霉素类超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素(氟苯尼考)同属于氯霉素类(CAPs)药物，甲砜霉素和氟苯尼考是新型氯霉素类广谱抗菌药物，其结构和药理活性与氯霉素类似，具有广谱抗菌能力并被广泛应用于动物养殖业。但氯霉素类药物用于食用性动物很容易导致在动物源性食品中残留量超标，具有导致人体产生再生障碍性贫血和溶血性贫血等毒副作用，对人体产生严重危害，因此引起了国内外的广泛重视。 目前，大多数国家已经严格限制其使用，并对食品中氯霉素类药物的最高残留限量(MRL)做了规定：欧盟规定氯霉素不得检出，甲砜霉素为50 ug/kg；对有鳍鱼类氟苯尼考为1000 ug/kg； 我国GB/T20756-2006规定氯霉素检出限0.1 pg/kg， 甲砜霉素和氟苯尼考检出限为1 ug/kg. 纵观国内外文献报道氯霉素类药物的检测方法主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)和液相色谱-质谱联用法(LC/MS)等，这些方法主要是测试一种氯霉素药物残留的分析方法，而三种药物同时检测的方法报道较少。目前国内在水产品中测定这三种药物的测定方法主要参考GB/T 20756-2006(液相色谱-串联质谱法)和农业部958号公告-14-2007(气相色谱-质谱法)，但是多数国家检测甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素三种药物比较精密的方法还是首推液相色谱-串联质谱法。因此，本文使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8030联用，建立了水产品中氯霉素类药残留的分析方法，此方法快速、选择性强和灵敏度高，供相关检测人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8030 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30A 柱温箱， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8030 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.42 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 分析仪器：LC-30A系统 色谱柱： Shimadzu Shim-pack XR-ODS II 2.0 mmI.D.x50 mmL.， 1.6 pm 流动相：A一水；B-乙腈 流速：0.4mL/min 进样体积：：10uL 柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为30%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 30 1.50 Pumps Pump B Conc. 60 2.00 Pumps Pump B Conc. 60 2.01 Pumps Pump B Conc. 30 4.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8030 离子源： ESI， 负离子扫描 离子源接口电压：-3.5kV 雾化气：氮气3.0L/min 干燥气：氮气15 L/min 碰撞气：氩气 脱溶剂管温度：250℃ 加热模块温度：400℃ 扫描模式：多反应监测 (MRM) 驻留时间：40ms 延迟时间：3ms MRM参数： MRM分组采集，见表2 表2MRM参数 编号 前体 产物 Q1 Pre CE(V) Q3 Pre 名称 离子 离子 Bias(V) Bias( V) 1 354.0 185.0 27 22 19 甲砜霉素 289.9 27 12 20 2 356.0 336.0" 13 10 23 氟甲砜霉素 185.0 13 20 19 3 氯霉素 321.0 152.1 25 18 15 257.0 25 12 18 *表示定量离子 1.3样品制备 标准物质：共3种，分别为甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素。 标准溶液配制： 用甲醇配制 10 mg/L 的混合标准中间溶液，用甲醇-水溶液(V/V， 50：50)稀释成0.2ug/L、0.5 ug/L、1 ug/L、5 ug/L、10 ug/L、50 ug/L 和 100 ug/L 不同浓度的混合标准工作液。样品前处理方法：称取5.0g试样(精确至0.01 g)至50 mL离心管中，加入25mL乙酸乙酯，在匀质器中以14000 r/min匀质30 s， 以4000 r/min离心5 min， 上层乙酸乙酯提取液收集于50 mL平底烧瓶中，残渣加入20 mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并提取液；45℃减压旋转浓缩至干，残留物用1 mL甲醇-水溶液(V/V，50：50)溶解，再加入3.0mL正己烷混合，并转移至10mL比色管中，涡动混合30s；；以4000 r/min离心2 min， 弃去上层正己烷，移取下层，经0.22 um微孔滤膜过滤 后，用液质分析。 2. 结果讨论 2.1标准样品一级质谱图和产物离子扫描质谱图 图1甲砜霉素的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE值20V， 右图) 图2氟甲砜霉素的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE值16V，右图) 图3氯霉素的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图 (CE值18V，右图) 2.2标准样品的 MRM 色谱图 混合标准样品的 MRM 色谱如图4所示。 图41 ug/L 混合标准样品的 MRM 色谱图 2.3线性关系 将浓度为0.2， 0.5， 1， 5， 10，50 和100 ug/L 甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素的混合标准工作液，按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，如图5~7所示。甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素线性良好。线性方程、线性范围和相关系数见表3. Area 图5甲砜霉素的标准工作曲线 图6氟甲砜霉素的标准工作曲线 图7氯霉素的标准工作曲线 表3 3种物质的校准曲线参数 编号 名称 线性范围 校准曲线 相关系数R 1 甲砜霉素 0.5~100 ug/L Y=(813.877)X+(2393.00) 0.9998 2 氟甲砜霉素 0.2~100 pg/L Y=(4198.77)X+(-157.491) 0.9996 3 氯霉素 0.2~100 ug/L Y=(2653.64)X+(1739.35) 0.9998 2.3检出限和定量限 配制7份混合标样，进样分析，对上述测定结果剔除离群值后将各自的7次测定结果计算其标准偏差S， 此时检出限MDL=3.14×S， 定量限LOQ=4×MDL。测定结果如表4所示： 表43种物质的检出限和定量限 No. 名称 浓度(pg/L) 标准偏扁(S) 检出限(ug/L) 定量限(ug/L) 1 甲砜霉素 0.50 0.033 0.102 0.41 2 氟甲砜霉素 0.20 0.014 0.043 0.17 3 氯霉素 0.20 0.011 0.038 0.15 2.4精密度实验 配制如表5浓度的混合标液，平行进样6次。3种目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.13~0.54%和1.68~4.31%之间，仪器精密度良好。 表5保留时间和峰面积重复性结果(n=6) No. 名称 RSD% (0.5 ug/L) RSD% (10 ug/L) RSD%(100 ug/L) R.T Area R.T Area R.T Area 1 甲砜霉素 0.54 4.31 0.15 3.34 0.25 1.51 2 氟甲砜霉素 0.40 2.66 0.09 2.39 0.16 1.87 3 氯霉素 0.38 2.26 0.16 1.68 0.13 1.98 2.5基质加标实验 在按照1.3中样品制备方法，样品中添加混合标样，加标含量如表6，各平行4次。测试结果显示：虾的样品加标回收率在81.5~105.5%之间；具体结果如表6。虾的基体空白色谱图如图8所示，虾的加标样品色谱图如图9所示。 图8虾的基体空白色谱图 图9 0.1 ug/kg 样品基质加标样色谱图 表6加标样的回收率结果(n=4) No. 样品名称 回收率(%) 0.1 pg/kg 1 pg/kg 20 pg/kg 甲砜霉素 84.8 90.3 105.5 2 氟甲砜霉素 89.8 83.7 81.5 3 氯霉素 96.9 99.8 93.3 3.结论 使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8030 联用测定水产品中甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素药物残留。3种物质的线性良好，相关系数均大于 0.999。甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素的检出限分别为0.10、0.04和 0.04 ug/L， 定量限分别为0.41、0.17和0.15 ug/L； 基质加标回收率在81.5~105.5%之间。此法中对0.1 ug/kg氯霉素类药物进行基体加标，如图9所示有明显响应，且回收率良好，完全满足 GB/T 20756-2006以及欧盟对甲砜霉素、氟甲砜霉素和氯霉素的最高残留量的要求，并且甲砜霉素和氟甲砜霉素方法定量限低于标准规定。此方法快速、选择性强和灵敏度高，可作为水产品中氯霉素类药物的日常检测方法。