动物组织和水产品中氯霉素类的残留量检测方案(固相萃取仪)

智能文字提取功能测试中

Raykol Applications Collection-RKFT-F015 全自动固相萃取-液相色谱质谱测定动物组织和水产品中氯霉素类的残留量 氯霉素类药物是一类广谱性抗生素，作为药物常用于家禽疾病治疗和预防。由于氯霉素对人体有严重的毒副作用，目前美国、日本、韩国和欧盟等国家和地区均已禁止在食用性动物中使用氯霉素，并规定在动物源性食品中不得检出。本实验参考GB/T 22338-2008中的方法，均质样品后采用全自动固相萃取仪实现自动化净化浓缩样品，大大提高 关键字：高效液相色谱/串联质谱，固相萃取，氯霉素 2.仪器、耗材与试剂 2.1仪器、耗材 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪(睿科) 硅胶固相萃取小柱 (Agilent Bond Elut SI，500mg/3mL) 液相色谱-质谱联用仪(Aglent 1260+Agilent6410， ESI负离子模式) Agilent EC-C18(2.7 umx3.0mmx50 mm)均质机(Fluko， FA25) 离心机(湘仪，H-2050R) 旋转蒸发仪(IKA°RV10 basic， IKA°HB10 3.样品提取与前处理 3.1样品前处理 称取 5.00g(±0.01)试样，加入5 g左右的无水硫酸钠；加入一定量氯霉素类混合标准物质工作液，加入20mL乙腈，均质1 min， 再用20mL乙腈清洗均质刀头，以5500 r/min 离心5 min， 转移上清液于分液漏斗中，加15 mL 乙腈饱和正己烷除脂，弃去上层正己烷层。残渣中再加入20 mL乙腈，振摇 3 min， 以5500 r/min 离心5 min， 取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min， 静置分层，取下层乙腈层于鸡心瓶中，加入5mL异丙醇，旋转蒸发至近干。加入5 mL丙酮+正己烷(1：9)，振荡后转移到上样瓶中，过柱净化。 效率。采用HPLC/MS 电喷雾(EST)，多反应监测(MRM)模式检测。氯霉素和氟甲砜霉素在添加浓度为 0.1~5.0ug.Kg范围内，回收率分别为84.95~97.95%，72.57~91.7%之间；甲砜霉素在添加浓度为1.0~5.0ug.Kg范围内，回收率在69.93~91.75%之间；相对标准偏差 RSD(n=4)在4.2~12.3%之间。方法的准确度和精密度均符合残留分析要求。 basic) 涡旋混合器(IKA°MS3 basic) 2.2试剂与溶剂 丙酮(色谱纯，西格玛公司)，正己烷(色谱纯，西格玛公司)，乙腈(色谱纯，西格玛公司)，无水硫酸钠(AR.，国药)，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质(美国 sigma)。将上述标准物质以甲醇为溶剂配制成1 mg/mL的混合标准物质储备液，置于-20℃冰箱保存。 3.2固相萃取净化条件 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Fotector Plus or Fotector 02HT 固相萃取柱 硅胶固相萃取小柱 (Agilent Bond ElutSI， 500mg/3mL) 淋洗 丙酮/正己烷混合溶液(1：9) 洗脱 丙酮/正己烷混合溶液(6：4) 3.3净化 硅胶固相萃取小柱用10 mL 丙酮+正己烷(1+9)以20 mL/min 的速度活化；5 mL 丙酮+正己烷(1+9)溶解上步提取液取留物以1 mL/min 上样； 2mL丙 酮+正己烷(1+9)淋洗，5 mL丙酮+正己烷(6+4)溶液洗脱。洗脱液在40℃、5 psi 条件下浓缩至近 干，用1mL30%甲醇水定容。操作程序见下图-1所示。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 修积(mL) 时间Lmin 1 清洗样品通道 丙酮：正己己(1：9) 20 5 2 2 活化 丙酒：正己烷(1：9) 废液1 30 10 0.9 3 上样 废液1 2 5 3.1 4 清洗样品瓶 丙酮：正己烷(1：9) 废液1 60 3 2.3 5 淋洗 丙酮：正己烷(1：9) 废液1 2 2 1.4 6 气推 废液1 20 10 1.3 7 清洗注射泵 丙酮：正己烷(6：4) 60 3 0.4 8 洗脱 丙酮：正己烷(6：4) 收集 1 5 5.4 9 气推 收集 1 2 2.4 图-1. Fotector Plus 氯霉素固相萃取净化方法 4.检测条件 4.1液相色谱质谱联用条件 柱子 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 洗脱梯度 Waters XBridge BEH HILIC 2.5umx2.1 mmx50mm 0.200 mL/min A： HO， B： Methanol 30°C 10 pL Agilent 6410 ESI 11 L/min 350°C 4000 35psi 0-1.5 min， 5%流动相B； 2-3.5 min， 70%流动相B， 5.0-6.0 min， 5%流动相B 4.2 MRM 参数 名称 定性离子对 定量离子对 去簇电压 碰撞气流 保留时间 分子量MW m/z m/z DP/V CE/V /min 氯霉素 323 321.1/257.1 321.1/152.0 120 5 6.03 Chloramphenicol 321.1/52.1 120 10 氟甲砜霉素 358 356.1/184.9 356.1/184.9 135 4 3.34 Florfenicol 356.1/85.1 135 12 甲砜霉素 356 353.9/90.0 353.9/184.9 130 4 2.52 15 4.3标准样品MRM 色谱图 图-2.三种氯霉素的色谱图(5ug/L，左-氯霉素，中-氟甲砜霉素，右-甲砜霉素) 5.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需用空白样品提取液来配制一系列混标标准工作曲线。组分系列浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 ug/kg 以各组分的质量浓度(X， ug/L)对峰面积(Y)绘制标准工作曲线。如果基质标准曲线响应与标准曲线响应相似，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求 R²>0.99；此曲线两周需要重新配置一次。 5.2样品基质加标测试 在5g空白猪肉和鱼肉样品中分别添加0.1、1.0、5.0ug.kg氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素混标。回 6.结果与讨论 6.1提取溶剂选择 氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮和乙腈等，文献报道多采用碱化乙酸乙酯提取，可以得到很好的回收率。本实验参考GB/T 22338-2008 方法，用乙腈提取食品中的氯霉 收率及精密度见表-2。从表中数据看出，3个浓度加标，不同基质中的加标回收率均在69-98%之间，相对标准偏差小于15%，符合痕量残留检测的要求；而甲砜霉素在添加浓度 0.1 ug.kg的条件下，由于杂质干扰比较大，仪器灵敏度不够高，造成未检出。 表-2.不同样品基质加标回收率及 RSD 值 名称 添加浓 猪肉基质 鱼肉基质 度 回收 RSD 回收 RSD /pg.kg 率/% (n=4) /% 率/% (n=4) /% 氯霉 84.95 10.1 88.30 11.3 97.95 4.2 87.18 83 素 5.0 92.37 5.1 88.34 氟甲 74.80 12.3 91.70 砜霉 83.42 46 72.57 素 85.01 75.54 甲砜 1.0 91.75 10.9 69.93 8.4 霉素 5.0 84.57 6.8 80.03 7.5 素类药物。 6.2净化柱的选择 根据提取的方法不同，可选择多种净化小柱，大量文献报道多采用 HLB、C18与硅胶小柱联用，均取得比较理想的效果。由于 HLB 和C18固相萃 取小柱价格比较贵，洗脱溶剂比较多的特点，本实验采用硅胶小柱净化提取液，方法简便快捷，成本 7.仪器优势 睿科 AH 300全自动均质器通过高速运转的刀头对鱼肉等肉类基质进行打浆粉碎，可选择自带水、有机溶剂及超声波三种清洗模式对刀头进行自动化清洗，防止不同基质在刀头上的残留带来的交叉污染，也避免手动清洗的繁琐，从而来实现更好的均质效果，提高处理效率。 睿科Fotector Plus 全自动固相萃取仪在对动物组织和水产品中氯霉素类化合物进行固相萃取净化时，使用高精度注射器和十二通阀切换等动作，实现了活化、上样、淋洗、洗脱整个固相萃取过程的全自动化，6通道同时运行，8种溶剂可选，3种 排废可选，还带有自动清洗样品瓶的功能来防止目标化合物在瓶壁上的残留，实现全自动化过程的同时保证了回收率。 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪可一次性平行浓缩60位样品，处理样品通量高操作；；可智能判断浓缩过程，氮吹针自动跟随浓缩液面下降，浓缩效率高，消耗氮气量少；具有可视玻璃设计，可实时观察浓缩状态；能够与睿科 Fotector Plus 全自动固相萃取仪进行完美搭配，，二者氮吹试管架与收集架能够完美兼容，操作简单便捷，也减少洗脱液再转移时带来的损失。 邮箱： info@raykol.com网址：： www.raykol.com热线： 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 本实验参考GB/T 22338-2008中的方法，均质样品后采用全自动固相萃取仪实现自动化净化浓缩样品，大大提高效率。采用HPLC/MS电喷雾（ESI-），多反应监测（MRM）模式检测。氯霉素和氟甲砜霉素在添加浓度为0.1～5.0µg.Kg-1范围内，回收率分别为84.95～97.95%，72.57～91.7%之间；甲砜霉素在添加浓度为1.0～5.0µg.Kg-1范围内，回收率在69.93～91.75%之间；相对标准偏差RSD（n=4）在4.2～12.3%之间。方法的准确度和精密度均符合残留分析要求。