生鲜畜禽肉中二苯乙烯类激素检测方案

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)(纳铭仪器nano instrument分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)第26卷第1期2007年1月 许 泓等：自动固相萃取/高效液相色谱-质谱/质谱检测动物源性食品中残留二苯乙烯类激素的方法研究第1期21 自动固相萃取/高效液相色谱-质谱/质谱检测动物源性食品中残留二苯乙烯类激素的方法研究 许 泓，林安清，古 珑，唐丹舟，何 佳(天津出入境检验检疫局，天津300201) 摘 要：应用自动固相萃取仪(ASPE)/高效液相色谱-质谱/质谱仪(HPLC-MS/MS)同时分析动物源性食品中残留二苯乙烯类激素——一烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEX)、双烯雌酚(DEN)。样品净化采用装配硅胶固相萃取柱的 ASPE，液相色谱分离用C。柱，大气压化学模式电离，多反应离子监离方式检测， DES-d8 同位素标记物做内标定量。方法对 DES、DEN 的检出检为0.05 ng'g， 在0.5~10 ngg范围内回收率为 84%~108%； 对 HEX 的检出限为0.025 ngg，在0.25~5ng吕g范围内回收率为 59%~87%. 关键词：自动固相萃取；高效液相色谱-质谱/质谱；残留；二苯乙烯类激素；动物源性食品 中图分类号：0657.6；R977.1 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2007)01-0020-04 Determination of Stilbene Hormones Residues in Foodstuffs of Animal Originby Automated Solid-phase Extraction/High-performance LiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry XU Hong， LIN An-qing， GU Long， TANG Dan-zhou， HE Jia (Tianjin Inspection and Quarantine Bureau， Tianjin 300201， China) Abstract： A high-performance liquid chromatographic(HPLC)-tandem mass spectrometry (MS/MS)method was developed to analyse three stilbenes in foodstuffs of animal origin simultaneously， includingdiethylstilbestrol(DES)， hexestrol(HEX)， and dienoestrol(DEN). Sample clean-up and analyte en-richment were performed by automated solid-phase extraction(ASPE) with a silica gel column. Identifi-cation and quantification were carried out using atmospheric pressure chemical ionization mode andmultiple reaction monitoring(MRM). DES-d8 was used as an internal standard. The limits of detectionfor DES and DEN were 0.05 ng g and the recovery reached 84%-108% in the range of 0.5 -10ngg. The limit of detection HEX was 0.025 ng g and the recovery was 59%-87%iirn therange of 0.25-5 ngg . Key words： Automated solid-phase extraction； High-performance liquid chromatography - tandemmass spectrometry； Residues； Stilbene hormones； Foodstuffs of animal origin 二苯乙烯类激素包括己烯雌酚(diethylstilbestrol， DES)、己烷雌酚( hexestrol， HEX)、双烯雌酚( di-eno-estrol， DEN)， 20世纪60年代曾作为促生长剂用于畜牧业生产。80年代毒理研究表明该类药物可诱发癌症，欧盟公布法令禁止在畜牧业生产中使用21，2002年我国农业部亦将其列为禁用药3。残留二苯乙烯类激素的传统检测方法有很多种中4-8]，但都存在缺陷而难以满足欧盟指令的要求。高效液相色谱-质谱/质谱仪(HPLC-MS/MS)具有检测灵敏度高、线性范围宽、定量重复性好、定性准准等优点，近年已用于残留激素分素110-12]，但未见用于二苯乙烯类激素残留量检测方法的报道。本研究采用自动固相萃取仪(ASPE)净化， HPLC -MS/MS检测，同位素标记物作内标定量，建立了动物源性食品中残留二苯乙烯类激素分析方法。 ( 收稿日期：2006-01-04；修回日期：2006-04-03 ) ( 基金项目：国家质量监督检验检疫总局科研课题资助项目(2005IK024) ) ( 作者简介：许 泓(1956-)，男，江苏宜兴人，高级工程师， Tel：022-28374 4 05， E-mail： hongxxu @ yahoo. com. cn ) 实验部分 1.1 仪器与试剂 HPLC - MS/MS联用仪：1100-API 4000( Agilent-AB公司，美国)，配有大气压化学电离源，自动进样器。自动固相萃取仪： ASPEC Xli(Gilson 公司，美国)。液相色谱柱： ZORBAX Eclipse XDB-C8，150×4.6 mm， 5 pm(Agilent 公司，美国)。固相萃取柱：硅胶柱，500 mg(J.T. Baker 公司，美国)。 氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、正己烷、、-二氯甲烷、乙酸乙酯等为分析纯。叔丁基甲基醚(MTBE)、乙腈、甲醇为色谱纯(Merck公司，德国)。溶解液：正己烷-二氯甲烷(体积比60：40)。淋洗液：乙酸乙酯-正己烷(体积比6：94)。洗脱液：乙酸乙酯-正己烷(体积比25：75)。β-葡糖苷酸酶： H-2(Helix pomatia， Sigma 公司，美国)。标准品：己烯雌酚(DES)，完烷雌酚(HEX)，双烯雌酚(DEN)，纯度均不低于98% (Sigma 公司，美国)；与蛋白结合的己烯雌酚(Diethylstilbestrol glucuronide) (Sigma 公司，美国)。标准溶液分别用甲醇配制成1 g/L标准贮备溶液。内标：己烯雌酚同位素标记物(Ring-3，3'，5，5'-diethyl-1，1，1'，1'-d8， DES-d8)，纯度不低于 98%(Cambridge Isotope Laboratories 公司，美国)。内标标准溶液用甲醇配制成1 g/L标准贮备溶液。实验时以甲醇配制成所需浓度的混合标准和内标工作溶液。基质提取液：空白样品，不加 DES-d8 内标工作溶液，其它按1.2.1操作后得到。基质标准工作溶液：将标准工作溶液及内标溶液混合后在氮吹仪中吹干，以基质提取液溶解，涡旋30 s后定容。 1.2 实验方法 1.2.1 提取与净化 称尔碎混匀后样品5.0g于离心管中，加入20 mL MTBE， 1 mL DES-d8 内标溶液(5ug/L)，高速均质1 min。 3 000 r/min 离心5 min，上清液转移至另一试管中。离心管中残渣置于通风橱中挥发 30 min， 加入15 mL乙酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH=5.2)，高速均质1 min。 3 000 r/min 离心5 min， 上清液转移至具塞试管中，并在40℃水浴氮吹仪中吹去残余MTBE 后，加入80 p.L β-葡糖苷酸酶，于52℃烘箱中放置过夜。在水溶液中加入氢氧化钠溶液(3 mmol/L)将溶液 pH值调至7， 加入10 mL MTBE， 充分混合，3 000 r/min 离心2 min。移取 MTBE 层与前面的 MTBE 提取液混合在氮吹仪上于40℃水浴中吹干。加入1 mL溶解液，涡旋30s溶解，准备过柱。 用6 mL 正己烷分两次预洗硅胶柱，流速4mL/min。上样，流速2 mL/min，在样品试管中加入3mL 淋洗液，混合后过柱，流速2mL/min。用3mL淋洗液以3 mL/min 流速淋洗， 2 mL空气流以4mL/min 流速吹过硅胶柱。用6 mL洗脱液洗脱，流速2mL/min， 2 mL 空气流以6 mL/min 流速吹过硅胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮吹仪上于40℃水浴中吹干，加1mL流动相，涡旋30 s溶解。溶液经0.45 um 有机微孔滤膜过滤后，收集样品供 HPLC -MS/MS 测定。 1.2.2HPLC-MS/MS 实验条件 HPLC 条件：流动相为乙腈-水(体积比70：30)，流速1.0mL/min；进样量 50 uL。 MS/MS条件：电离方式APCI(-)， 离子源温度325℃；气帘气压力6.89×10 Pa；雾化气压力1.03×10°Pa；辅助气1压力2.41×10°Pa； 喷雾器电流-5 pA；电喷雾电压-4500V。检测以多反应监测(MRM)方式扫描，测定二苯乙烯类激素的负离子。监测离子见表1。 表1 二苯乙烯类激素在多反应监测方式下的监测离子及其相应参数 Table 1 Diagnostic ions of stilbenes and parameters in MRM Analyte Ions pair(离子对) Declustering potential Entrance potential Collision energy Collision cell exit potential 被测物 Q1→Q3** 锥体电压(U/V) 入口电压(U/V) 碰撞气能量(U/V) 碰撞室出口电压(U/V) DES 267.0→222.1*，237.1 -90，-90 -10，-10 -40，-40 -10，-10 DEN 265.0一221.1，235.1" -90，-90 -10， -10 -35，-32 -7，-7 HEX 269.0→134.0*，119.0 -75，-75 -10，-10 -22，-46 -7，-7 DES-d8 275.1→227.9*，245.0 -74，-73 -5， -5 -40，-40 -15，-15 *为定量离子；**Q1为母离子，Q3为子离子( * the quantification ions； ** Q1 the parent ion， Q3 the daughter ion) 1.2.3 测 定 定性：进行样品测定时，如果被测成分质量色谱峰的保留时间与标准品一致，且在扣除背景后的样品质谱图中所选择离子对均出现，而所选择离子对的丰度比值与标准品离子对的丰度比值相差在允值范围内，则可判断样品中存在相应的兽药。 定量：采用内标法计算，计算结果需扣除空白值。每一种组分残留量所选定量离子见表1。 2 结果与讨论 2. 1 样品前处理 2.1.1 被测物的提取 动物源性食品中二苯乙烯类激素的提取，不同文献有所不同[8，14]。但在实验中发现均存在缺陷。如 P. Marchand 等人的方法[8]，以甲醇和乙酸盐的缓冲液混合提取样品，为保证酶解效率须将甲醇除净，但这一步需耗费相当长时间。且该方法以甲醇作为对样品中二苯乙烯类激素的提取溶剂，以乙醚作为从酶解后乙酸盐缓冲液中提取二苯乙烯类激素溶剂，提取效率不甚理想，回收率约30%。为此又试用乙酸乙酯和叔丁基甲基醚(MTBE)，其实验结果见表2。通过实验数据得到， MT-BE作为提取溶剂回收率最好，因而最终选取 MTBE。 在动物源性食品中二苯乙烯类激素以游离和与蛋白结合两种形式存在11，8，14]，加β-葡糖苷酸酶作为酶解剂可将与蛋白结合的二苯乙烯类激素转变成游离态。本实验应用与蛋白结合的 DES 标准做试验，结果加酶解剂后测定质量色谱峰面积值较未加的高约30%，因而对实际样品二苯乙烯类激素残留量进行检测，酶解是必不可少的步骤。本法采用两步提取，既保证与蛋白结合的二苯乙烯类激素能有效提取，又使分析过程效率提高。 表2 不同溶剂提取对回收率的影响 Table 2 Effect of extract solvent on recovery Extract solvent Analyte Recovery R/% Methanol(甲醇)， Ether(乙醚) DES HEX DEN Ethyl acetate(乙酸乙酯) DES HEX DEN Methyl tertiary butyl ether DES (叔丁基甲基醚) HEX DEN 2.1.2固相萃取净化HPLC - MS/MS 具有很好 的选择性，但好的样品净化可使离子化过程稳定，分析结果重现。本研究实验了不同牌号硅胶柱和Oasis 柱。经比较实验，最终选用J.T. Baker 硅胶柱。 固相萃取(SPE)条件优化决定净化效果和回收率。动物源性食品中痕量残留兽药分析实验操作难度大，采用传统手动 SPE 萃取装置，不可控参数多，结果重复性差。为此，本方法改用 ASPE， 重复性明显提高。 应用 ASPE 对淋洗液、洗脱液、洗脱液用量各项参数进行优化，实验结果得出：应用乙酸乙酯-正已烷(体积比6：94)淋洗液6mL， 去杂效果最好，且待测物没有被洗脱；应用乙酸乙酯-一烷(体积比25：75)洗脱液可得到最高的回收率；应用6 mL 洗脱液能将待测物洗脱93%，再提高洗脱液用量回收率没有明显提高而吹干时间将延长。 2.2 仪器条件参数的优化 2.2.1 HPLC条件的优化因乙腈具有显著的质子自递作用而在采用大气压化学电离(APCI)时为首选， APCI 电离推荐液相流速1 mL/min15]。在此前提下实验了不同流动相比例和梯度程序。由于流速较高，乙腈比例不宜低，最终选定乙腈-水体积比70：30。对比了不同梯度程序的分离结果，没有明显改善，而 HPLC -MS/MS 分析时不要求所得质量色谱峰如 HPLC 做到完全分离，为提高分析效率采用等度淋洗。实验对比了 Crg和 Cg HPLC 柱[10-12]。经实验 C， HPLC 柱对二苯乙烯类激素分离效果更好。 2.2.2 离子化方式的选择 电喷雾电离(ESI)具有极为乏泛的应用领域，小分子药物是其重要的分析对象16]。实验初期，应用二苯乙烯类激素标准品以 ESI(-)方式摸索实验条件，得到了比较满意的结果。但在应用实际动物源性食品样品后，基质干扰严重，数据重复性差，检出限仅能勉强达到残留监控文件要求的1 pg/kg 指标。，二苯乙烯类激素的化学结构中均带有二个羟基，文献中也报道该类化合物可溶解在缓冲溶液中[8]，理论上可采用 APCI 方式电离15]。为进一步提高检测灵敏度，试采用 APCI(-)重新实验。通过对 APCI(-)条件优化(见表1)，方法检出限(LOD)可达0.05 pg/kg， 基本上可与RIA 方法的灵敏度相匹配。 2.2.3MS参数的优化 二苯乙烯类激素均带2个羟基，因而易丢失1个H*，成为[M-H]准分子离子，通过第一级质量分析器(Q1)得到的质谱图，找出被测物对应的母离子(准分子离子)，见表1。经第二级碰撞(Q2)解离，第三级质量分析器(Q3)对解离产物进行分析，根据所得MS’质谱图，选择 丰度比较强的2个特征离子作为子离子。调谐相关参数，最终得到表1所列最佳参数。3种物质响应值较低离子对的样品回收质量色谱图见图1。 2.3 定性与定量离子的确定 二苯乙烯类激素是欧盟残留监控规定的禁用兽药，即A类兽药，按规定这类兽药在定性时确证点数不得少于4°。因此，按表1选择1个母离子和2个子离子可满足欧盟指令定性的要求。仪器检测灵敏度以离子丰度比较弱的信号/噪音(S/N)≥3，且离子间丰度比的变化应在允差范围内。 色-质联用定量时应选择离子丰度较强的离子!9，本实验所选定量离子见表1。检测动物源性食品中二苯乙烯类激素的残留量，由于基质复杂而对定量分析存在较严重的干扰，使定量的重现性难以满足要求。对于残留痕量分析，近年欧、美等国更提倡采用被测物的同位素标记物做内标161，定量准确且重复性好。为此实验选择 DES-d8做内标物，从实验第一步将其添加到实验样品中，校正了整个实验，提高了回收率和重现性，使整个方法更具操作性。 3 结 论 本研究建立了对动物源性食品中二苯乙烯类激素残留量准确定性和定量检测方法。方法通过对 ASPE 各项参数的实验，找出了最佳淋洗液、洗脱液比例以及洗脱液用量。经对 HPLC - MS/MS各项参数的调谐，使仪器检测灵敏度达到最优化。DES、DEN 图1检出限回收 MRM 色谱图 Fig.1 MRM chromatograms ofstilbenessamples spiked at the limits of detection a. DES， diagnostic ion 267.0-237.1； b. DEN， diagnostic ion 265.0→235.1； c. HEX， diagnostic ion 269.0→119.0 的检出限为0.05 ng'g-1，在0.5~10ngg范围内回收率为84%-108%，相对标准偏差为4.02%~13.3%； 对 HEX的检出限为0.025 ngg， 在0.25~5 ng'g'范围内回收率为59%~87%。不同药物在不同基质液得到的线性相关系数 r 为0.9973~0.999 9，符合残留分析方法指令和基本规定的要求[9，13]。 ( 参考文献： ) 1朱蓓蕾.动物性食品药物药留[M].第一版.上海：上海科学技术出版社，1994： 72-98.234 ( The C ouncil of the European Uuion. Council Directive 81/602/EEC[S]. 1 981. ) ( 蔡辉益.常用饲料添加剂[M].第一版.北京：中国农业出版社，2003：265-267. ) ( COFFIN D E， PILON J C. Gas chromatographic deter m ination of diethylstilbestrol of residues i n a n imal t i ssues[J ] . J AOAC， 1973， 56(2)：352-357. ) ( [51 DONOHO A L， JOHN S ON W S， SIECK R F， et al. Gas ch r om a tographic determination of diethylstilbestrol and its glucu- ronide in cattle tissues[ J ]. J AOAC， 197 3 ， 56(4)：785-792. ) ( [6] REUVERX T H， PEROGORDO E， JIMENEZ R. 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