金桔中柠檬苦素检测方案

智能文字提取功能测试中

纳铭仪器nano instrument中国食品学报Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology第13卷 第2期2013年2月 中国食品学报2013年第2期178 超高效液相色谱法快速并同时检测金柑中柠檬苦素和诺米林 孟 鹏1.2 郑宝东* (福建农林大学食品科学学院 福州350002 2福建省产品质量检验研究院 福州350002) 摘要 采用超高效液相色谱(UPLC)技术，建立金柑中柠檬苦素和诺米林的快速、同时检测技术。样品经二氯甲烷超声波提取，ACQUITY UPLCM BEH Cig色谱柱(2.1 mmx100 mm，1.7 um)分离，以乙腈-水(45：55)为流动相，梯度洗脱，流速 0.3mL/min，柱温35℃，检波波长215 nm。柠檬苦素和诺米林可在3 min内实现同时分离、测定。柠檬苦素和诺米林分别在1~1780 u.g/mL 和1~1720 ug/mL 范围内线性关系良好(R?=0.9999)，方法检出限分别为 1.65 u.g/g和1.28u.g/g，加标回收率分别为97.19%~100.06%和95.35%~99.83%，相对标准偏差(RSD)均小于5%。本法分析时间短，灵敏度高，操作方便，结果准确，适用于金柑中柠檬苦素和诺米林的同时测定。 关键词 超高效液相色谱；柠檬苦素；诺米林；金柑 近年来，金柑果实因其营养丰富，风味独特，逐渐被消费者接受。由于金柑中柠檬苦素类化合物等苦味物质的存在，所以大大影响金柑产品的口感。研究表明，若强烈苦味的柠檬苦素和诺米林在果汁中含量超过 6 mg/L， 则果汁不适宜饮用"。据相关研究报道，柠檬苦素在水溶液中的苦味阈值约6 mg/L，比柚皮苷要苦20倍2.这些苦味物质虽然影响金柑产品的口感，但其具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等功能3-4，应用价值很高。对金柑中苦味物质进行研究，不仅有利于金柑的深加工，而且有利于开发利用金柑中苦味物质。 研究金柑中的苦味物质，需要一种精确定量的分析方法。目前报道的检测方法很多，主要有HPLC 法5-6Davis 法"、TLC 法、UV 法、RIA法等1101。以上方法中 Davis 法测定步骤繁琐；UV 法仅适于对柠檬苦素类化合物总量的测定；TLC 法因依靠目测定量，测试结果误差较大；RIA 法检测不仅需用昂贵的计数器，而且还存在放射性保护和废物处理等问题。目前多采用 HPLC 法检测柠檬苦素类化合物，但由于果汁中柠檬苦素类化合物含量较低，该方法线性范围和检出限达不到检测 ( 收稿日期：2012-03-03 ) ( 基金项目：福建省科技创新平台建设项目(2009N2002) ) ( 作者简介：孟鹏，男，1980年出生，博士生，工程师 ) ( 通讯作者：郑宝东 ) 要求，所以测定结果有误差。截至发稿前，对于应用超高效液相色谱法同时测定柠檬苦素和诺米林的检测方法未见报道。 随着色谱柱填料技术的发展，超高效液相色谱 (ultra performance liliquid chromatography，U-PLC)技术比传统的 HPLC 技术具有更高的分离能力，大大改善了分析速度、灵敏度和分离度"。本文旨在建立 UPLC 同时测定金柑中柠檬苦素和诺米林的分析方法，以实现柠檬苦素类化合物快速、准确的检测，从而丰富柠檬苦素类化合物检测手段。 材料与方法 1.1 材料 金术：采于福建尤溪，去籽，45℃热风烘干至恒重，粉碎过40目筛，备用。 1.2 试剂 柠檬苦素(Limonin)和诺米林(Nomilin)标样，购自SIGMA公司；乙腈(色谱纯)、二氯甲烷(分析纯)、乙醇(分析纯)。水为超纯水。 标准溶液配制：分别称取柠檬苦素和诺米林标准品0.0178g和0.0172g，用乙腈溶解并定容至10mL。分别配制成含柠檬苦素1.78 mg/mL 和诺米林1.72 mg/mL 的标准使用溶液。 1.3 仪器与设备 ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪，美国 Waters 公司；分析天平，德国赛多利斯；高速组织捣碎机(FW135)，天津市台斯特仪器有限公司；超声波振荡器(DS-8510 DTH)，上海生析超声仪器有限公司；高速冷冻离心机(AvantiJ-E)，美国贝克曼公司；旋转蒸发仪(RE-52AA)，上海亚荣仪器生化厂；Milli-Q超纯水纯化系统，美国 Millipore 公司；涡旋混合器。 入 100 mL 提取溶剂，50℃水浴回流提取。 超声提取法：取金柑粉末5.0g于烧瓶中，加入100 mL提取溶剂，超声波提取。 提取液过滤后，滤液在50℃真空旋转蒸发至干，用乙腈溶解残渣并定容至100 mL，混匀，用0.22 pm 滤膜过滤，备用。 1.4 色谱条件 2 结果与分析 色谱柱：ACQUITY UPLCM BEH Cig柱(2.1mmx100 mm，1.7um)，美国 Waters 公司；流动相：V乙腈V水(45：55)；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；进样体积：2pL；检测波长：215nm；流动相梯度程序：等度洗脱。 2.1 检测波长 1.5 待测样品溶液的提取 水浴提取法：取金柑粉末5.0g于烧瓶中，加 根据柠檬苦素和诺米林的特征吸收，以乙腈为空白，采用 PDA 检测器在200~400 nm 范围内对一定浓度的柠檬苦素和诺米林标准溶液进行紫外扫描(如图1所示)，结果表明柠檬苦素和诺米林在215 nm处有最大吸收，因此选择215 nm为检测波长。 图1 柠檬苦素和诺米林的紫外扫描吸收图谱 Fig.l The UV-scan chromatograms of limonin and nomilin 2.2 提取方法的优化 2.2.1 提取溶剂 根据文献[12]，选择二氯甲烷、乙醇、丙酮3种溶剂50℃水浴提取1h，结果见表1.二氯甲烷提取效果最佳。 表1 不同溶剂对柠檬苦素和诺米林的提取率 Table 1 The efficiency of different solventson extracting limonin and nomilin 溶剂 柠檬苦素/mg'g 诺米林/mg'g y-1 二氯甲烷 0.86 0.091 丙酮 0.70 0.088 乙醇 0.62 0.082 2.2.2 提取方法 采用二氯甲烷作提取溶剂，比较水浴提取法和超声波提取法，结果见表2。超声波方法对柠檬苦素和诺米林的提取效率明显高于水浴法，且超声波提取1h后，提取率基本稳定。 表2 不同提取方法对柠檬苦素和诺米林的提取率 Table 2 The efficiency of different method on extractinglimonin and nomilin 提取方法 时间/h柠檬苦素/mg'gy-1 诺米林/mg'g 水浴提取 1.0 0.86 0.091 1.5 0.92 0.093 2.0 0.95 0.099 超声波提取 0.5 0.92 0.090 1.0 1.16 0.12 1.5 1.17 0.12 2.3 流动相 分别以不同比例的乙腈-水为流动相进样，分析表明，当乙腈体积分数30%~50%时，柠檬苦素和诺米林两种物质被分离开来。考虑到分析时间、乙腈用量和样品中杂质的干扰等因素，选择体积 分数45%乙腈作流动相。该条件下柠檬苦素和诺米林的分离度高，峰形较好，保留时间分别为2.35min 和2.97 min。柠檬苦素和诺米林的标准品色谱图、样品的色谱图分别见图2、图3。 5.00 时间/min 图2 柠檬苦素、诺米林标准品 UPLC 色谱图 图3 样品的 UPLC 色谱图 Fig.2The UPLC chromatogram of limonin andnomilin standards Fig.3The UPLC chromatogram of the sample 2.4 线性范围和检出限 精密吸取柠檬苦素和诺米林标准使用溶液，配制成梯度稀释液，在选定的色谱条件下进样2pL，分析。分别以柠檬苦素和诺米林的质量浓度(ug/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算其回归方程，结果见表3，图4。柠檬苦素和诺米林的回归方程分别为Y=3970X+2080，Y=3490X+4380，回归方程的R?值均为0.9999。柠檬苦素的线性范围为1~1780 ug/mL，诺米林的线性范围为1~1720 pg/mL，这两种物质在较宽的质量浓度范围呈现良好的线性关系。 表3 柠檬苦素和诺米林标准曲线的线性范围和相关系数 Table 33The linear range and regression equation ofthe calibration curve for limonin and nomilin 线性范围/ 回归方程 相关 ug'mL- 系数 柠檬苦素 1~1780 Y=3970X +2080 0.999 诺米林 1~1720 Y=3490X +4380 0.999 2.5 检出限 依据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的规定，检出限以信噪比 S/N>3 计3。以测定仪器的3倍信噪比(S/N=3，LOD)计算，本方法中柠檬苦素和诺米林的检出限(LOD)分别为1.65 ug/g 和1.28ug/g。 2.6 回收率和精密度试验 称取金柑粉，分别加入一定量的柠檬苦素和 诺米林标准溶液，运用所建立的方法，对金柑粉和加标金柑粉进行预处理和色谱分析，结果见表4。柠檬苦素的加标回收率在97.19%~100.06%之间，相对标准偏差(RSD)0.74%~2.25%。诺米林的加标回收率在 95.35%~99.83%之间，相对标准偏差(RSD)0.80%~3.36%，符合方法学分析要求。 图4 柠檬苦素和诺米林的标准工作曲线 Fig.4 The standard curve of limonin and nomilin 表4 加标回收率实验结果 Table 4 Result of addition recovery experiment 样品含量/mg 添加量/mg 测定量/mg 回收率/% 标准偏差*(RSD)/% 柠檬苦素 1.25 1.78 2.98 97.19 2.25 8.90 10.13 99.78 1.23 17.80 19.06 100.06 0.74 诺米林 0.14 1.72 1.78 95.35 3.36 8.60 8.64 98.84 2.30 17.20 17.31 99.83 0.80 *：平行样品数n=5。 2.7 UPLC 检测体系的实际应用 采用上述 UPLC 检测体系，对市售的琯溪蜜柚、脐橙、柑橘，烘干、粉碎、提取后检测，结果见表5。 表5不同样品中柠檬苦素和诺米林的含量(mg/g DW) Fig.5The contents of limonin and nomilin in differentsamples(mg/g DW) 样品名称 柠檬苦素 诺米林 脐橙 1.42 1.99 琯溪蜜柚 3.21 1.87 柑橘 0.95 0.47 尤溪金柑 1.24 0.16 3 讨论 1)采用传统高效液相色谱测定柠檬苦素和诺米林已有研究报道。孙崇德2、黄高凌4等利用 HPLC 法对柑橘和蜜柚中的柠檬苦素和诺米林进行检测，方法精度高，重复性好，但检测范围为 4.3~186.25 ug/mL。在日常检测中，柑橘类水果中的柠檬苦素浓度均超过此线性范围。本文采用 UPLC检测技术，通过优化色谱条件，将柠檬苦素和诺米林的线性范围分围扩大为1~1780 pg/mL 和1~1720 pg/mL，且范围内线性关系良好(R’=0.9999)。 刘亮等5人用 HPLC 法分析两种物质需16min，流动相消耗量为16mL(流速1.0mL/min)。本文采用 UPLC 法，在3 min 内即可完成1次进样分离，流动相消耗仅0.9mL(流速 0.3mL/min)，在保证分离度的同时，大大缩短了分析时间，减少了溶剂消耗，降低了分析成本。相比传统 HPLC 法，U-PLC 的分离效果和分析效率均有极大地提高。 2)本文建立的柠檬苦素和诺米林的UPLC检测体系，具有高效、合理、准确和重复性好等特点，可用于金柑果实中柠檬苦素类化合物的提取与检测。为金柑柠檬苦素类化合物的进一步开发利用奠定了基础。 ( 参 考 文 献 ) ( [1] Hashinaga F ， E j ima H ， Nag a hama H， e t a l . 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The analyses were performed on UPLC with an ACQUITY UPLCM BEH Cig column(2.1mmx100 mm，1.7 um)， using acetonitrile-water (45：55，V/V) as the mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min. The col-umn temperature is measured 35 ℃， with a detection wavelength of 215 nm. The two compounds were effectively separat-ed by gadient elution and detected by PDA in 3 minutes. The Calibration curve were good linear in the range of 1~1 780 pg/mL for limonin and 1~1 720 ug/mL for nomilin， the correlation coefficient were both 0.9999. The limits of de-tection(LOD) were 1.65 ug/g and 1.28 ugg. The additon recoveries were 97.19%~100.06% and 95.35%~99.83%， respec-tively. The relative standard deviations were less than 5%. The result indicated that the method is rapid， sensitive， con-venient， accurate and may be used for determination of limonin and nomilin in kumquat. Key wodsultra performance liquid chromatography(UPLC)； limonin； nomilin； kumquat ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. 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