柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d检测方案(液相色谱仪)

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高效液相色谱法测定柴胡中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量 柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinese DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzoneri folium Willd.的干燥根。按性状不同，分别习惯称为“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡作为常用中药，具有和解表里，疏肝升阳的功效，它的主要活性成分为柴胡皂苷。本文采用HPLC法测定了柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。 1 测试条件 1.1 仪器 分析型高效液相色谱仪（HPLC），由AS3000自动进样器，Lablliance Series 高压泵、DAD检测器和Lablliance色谱工作站组成，配一支C18 Kromasil 色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm, 5 um)；AXM-8 Temp.柱温箱。 1.2试剂和样品 柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品（中国药品生物制品检定所），乙腈（色谱纯），水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂为分析纯，柴胡样品购自当地药店。 1.3对照品溶液配制 精密称取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品适量，加甲醇分别配制成2.50 mg/mL、3.30 mg/mL对照品储备液，冷藏备用。 1.4供试品溶液的制备 精密称取样品粉末500 mg，置于锥形瓶中，精密加入2%氨水-甲醇20mL，置超声波清洗器中超声提取1 h，放冷，滤过，以甲醇10 mL分两次洗涤滤渣，合并滤液，置水浴上蒸干，放冷，精密加甲醇2 mL溶解，摇匀，以0.45um滤膜过滤，的供试品溶液，冷藏备用。 1.5色谱条件： 色谱柱：Kromasil (4. 6 mm × 250 mm, 5 um)； 流动相：乙腈-水溶液（v/v=40:60） 柱温：室温； 流速：1.0 mL/min； 检测波长：210 nm； 进样量：10 uL。 2测试结果 2.1检测波长的选择 文献报道的检测波长有203 nm、204 nm、210 nm，取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品溶液进行紫外光谱扫描，在210 nm有最大吸收峰，所以我们选用测定波长为210nm，所得对照品的高效液相色谱图见图1、图2。 图1 柴胡皂苷a对照品的高效液相色谱图 图2 柴胡皂苷d对照品的高效液相色谱图 2.2线性关系、方法检出限考察 分别移取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品溶液，分别以1、2、5、10、15 uL，进样分析。以峰面积Y为纵坐标，进样量X（ug）为横坐标，绘制标准曲线，得线性方程。柴胡皂苷a的线性回归方程为Y = 302856 X +3126.1，r = 0.9998，线性范围为2.50～37.5 ug。柴胡皂苷d的线性回归方程为Y = 259812 X +9753.5，r = 0.9998，线性范围为3.30～49.5 ug。 2.3精密度和重现性实验 精密吸取供试品10 uL，重复进样6次，结果柴胡皂苷a的 RSD为0.862%，柴胡皂苷d 的RSD为0.547%，表明方法精密度良好 。 取样品，按1.4条件制备6份供试品溶液，分别进样10 uL，测定峰面积，计算柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，含量测定结果柴胡皂苷a的 RSD为0.98%，柴胡皂苷d的 RSD为1.15%，表明方法重现性良好。 2.4稳定性实验 取样品溶液分别在0、2、4、8、10按1.5的色谱条件进样，（不测时于冰箱4℃冷藏），测定峰面积，结果表明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d在10 h内稳定性良好，RSD分别为1.302%、0.821% 2.5加标回收率实验 精密称取已知含量的样品，精密加入对照品柴胡皂苷a 2.0203mg，柴胡皂苷d 1.9953 mg，按1.4项下方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率，结果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的平均回收率分别为98.66%、94.93，RSD分别为0.376%、0.618（见表1和表2）。 表1 柴胡皂苷a加标回收试验结果 已知含量/mg 添加量/mg 测得值/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 2.1030 2.0203 4.0987 98.78 98.66 0.376 2.0998 2.0203 4.0862 98.32 2.1035 2.0203 4.1005 98.84 2.1130 2.0203 4.1153 99.11 2.0988 2.0203 4.0834 98.23 表2 柴胡皂苷d加标回收试验结果 已知含量/mg 添加量/mg 测得值/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 2.0956 1.9953 4.0023 95.56 94.93 0.618 2.1036 1.9953 4.0103 95.56 2.0987 1.9953 3.9862 94.60 2.1187 1.9953 4.0013 94.35 2.0979 1.9953 3.9846 94.56 3结论 采用高效液相色谱法测定柴胡中柴胡皂苷a和d的含量，经过精密度、回收率等实验考查，均符合要求。该方法灵敏，快速，准确，可用于对柴胡药材的质量进行评价。