多肽药物中哌啶检测方案(离子色谱仪)

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2AN_C_IC-093 在多肽的合成中，常用 FMOC 作为氨基保护基，而脱去FMOC 常用哌啶 -DMF脱去，因此哌啶会在最终合成的多肽中有所残留。而哌啶具有中等的毒性，是一种升压剂，半致死剂量为 50mg/kg，因此必须控制最终产物中的哌啶残留量，一般要求残留量在 200mg/kg。 哌啶的测定有顶空气相色谱法和液相离子对法4，但因为哌啶是饱和氮杂环，碱性强，因此两种方式分离结果都不好，灵敏度无法满足要求。而哌啶的 Pka=11.1， 碱性强于吡啶，应该可以用阳离子分离，抑制电导检测。 仪器 Thermo ScientificM DionexICS-2100 离子色谱系统，包括等度泵-淋洗液发生器 EGC ⅢII MSA (P/N 074535) -电导检测器 耗材 Thermo Scientific Target2M Nylon Syringe Filters (0.45 pm， 30 mm，P/N F2500-1) 一次性使用无菌注射器，1mL(上海双鸽实业有限公司) 去离子水 (Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC， P/N： 50131948) 标准溶液的制备 准确称取的0.100g哌啶标准品，定容到100mL，配制成浓度均为 1.000 g/L 的标准品储备液。以水逐级稀释成浓度分别为0.2、0.4、+、0.6、1.0、2.0 mg/L的标准工作溶液。 样品前处理 样品：准确称取 0.0650g样品，定容到30mL。过滤膜待测。 加标样品：配置20、40、80mg/L标准样，分别取50pL，用样品定容到5mL，成为加标样。 分析柱： lonPac CS17 分离柱，4x250 mm(P/N 060557) 保护柱： lonPac CG17 保护柱， 4 mm x 50 mm (P/N 060560) 淋洗液： 7mmol/LMSA 流速： 1.0mL/min 定量环： 125uL 柱温： 30℃ 检测器： 电导检测 抑制器： 阴离子自动电解连续再生微膜抑制器CSRS300-4mm (P/N 064556))，，抑制电流30mA1800 psi 背压：背景电电：0.3uS 结果与讨论 哌啶的碱性较强，且电离的N基后是饱和烷基环，因此极性较强，极性吸附效应较大。 CS17 柱比较适合用于分离极性有机胺。通过调整流动相，可以在12分钟内分离出所需检测的哌啶并且常见的阳离子对其没有干扰。如图1所示。 图1.阳离子标准溶液色谱图. 色谱峰：1-钠离子，2-铵离子，3-哌啶，4-钙离子 方法的线性范围、精密度、加标回收率和稳定性 标准品依次进样，结果以浓度(c， mg/L)为横坐标，以色谱峰面积(A)的平均值为纵坐标，绘制标准工作曲线，考察线性范围和检出限，如图2所示，结果见表1，由此算出检测限可达 1.0 mg/kg。 表1.标准工作曲线线性范围 被测离子 线性方程 线性相关系数 (R) 线性范围(mg/L) 检测限(mg/L) 哌啶 A=-0.0104C +0.2362*C 99.97 0.2-2.0 0.002 Standard Curve of Piperidine 图2.哌啶的标准工作曲线 取 0.4 ppm 加标的样品，重复测定7次。测量数据记录于表2_精度验证数据中，同时计算平均值，相对标准偏差。 测定次数 峰面积(pSxmin) 测量值(mg/L) 平均值 (mg/L) 标准偏差 1 0.1047 0.4523 0.4495 0.71% 2 0.1028 0.4441 3 0.1042 0.4500 4 0.1033 0.4464 5 0.1042 0.4503 6 0.1044 0.4508 7 0.1048 0.4529 测出样品原始浓度。用此样品溶液分别配制加标浓度为0.2mg/L、0.4mg/L 和 0.8mg/L 的加标样品，各测定3次，测出加标样品浓度。数据记录于表3-回收率验证数据中，同时计算出各浓度的加标回收率及平均加标回收率。 表3.回收率验证数据 样品号 原始样品值(mg/L) 理论加标值(mg/L) 测量值(mg/L) 回收率 (%) 平均回收率(100%) 加标1-1 0.0130 0.20 0.2276 107.3 108.2 加标1-2 0.2279 107.4 加标1-3 0.2321 109.6 力标2-1 0.40 0.4441 107.8 加标2-2 0.4500 109.2 加标2-3 0.4464 108.4 加标3-1 0.80 0.8812 108.5 加标3-2 0.8724 107.4 加标3-3 0.8805 108.4 样品测定 用此方法测定实际样品，结果如图3所示，测定溶液的中哌啶的浓度为 0.013mg/L。哌啶原始含量=测出浓度×30/0.0650=6.0mg/kg 图3.实际样品溶液色谱图 结论 本文采用采用离子色谱方法抑制电导检测，简单灵敏地测定出多肽中哌啶的含量，检测限可达1.0mg/kg 方法操作简单便捷，且重现性好，回收率高，适用于此类样品分析。但多肽的样品会污染柱子，当柱效降低时，出峰时间不断提前。建议出峰时间提前10%即用 MSA 加乙腈冲洗柱子。 ( 1. 邱芊，永永森，朱颐，申韦萍.固相多肽合成中氨基酸 保护的研究进展.化工时刊，2005，19( 6 )，56 -6 2. ) ( 2 . 梁诚.哌啶及其衍生物开发与应用.化工文摘，2004， 3， 3 0-31 . ) ( 3. 冯敏，王淼，王曦，赵春杰.顶空气相色谱法测定西尼 地平原料药中残留的三乙胺和哌啶.华西医药杂志， 2014，29 ( 5)， 59 6-598. ) ( 4 王淼煜，于泓，李萍， 李杰，高玉凤.离子对色 谱-间接紫外检测法分析哌啶离子液体阳离子.色谱， 2014， 07 ) Determination of Piperidine in Peptide with ionchromatography Zhong Xinlin 1. ThermoFisher Scientific (China)， Guangzhou， China； Abstract： Based on ion chromatography， we developed a simple andsensitive method for Piperidine detection in Peptide. The analysis hadgood reproducibility and Accuracy.It is easy to operate and had highsensitivity。 ( Keywords ) Piperidine， Peptide， conductivity detection， ion chromatography