红细胞保存液中腺嘌呤和枸橼酸检测方案(液相色谱仪)

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引言 在较为早期的文献中，腺嘌呤也称为维生素B4。但是现在已经不再将其视为真正的维生素；属于B群维生素的烟碱酸与核黄素，可以和与腺嘌呤组合成生物必需的辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。腺嘌呤是核酸的组成部分，在体内参与RNA 和 DNA合成，在实际应用中，腺嘌呤可提高血液在4℃贮存期间的活性水平，红细胞依赖腺嘌呤转变为磷酸腺苷(AMP)并进一步磷酸化生成 ATP为红细胞新陈代谢活力提供高能化合物来源，大大延长血液在4℃的保存时间。枸橼酸又名柠檬酸，其中，柠檬酸钠是目前最重要的柠檬酸盐，鉴于其安全无毒性，生物降解性，与金属离子络合能力较好，且具有良良的 pH调节，溶解性及缓冲性能，使得其具有十分广泛的用途。利用柠檬酸根与Ca能形成可溶性络合物的特性，用作抗凝血剂和输血剂，保存和加工血制品。枸橼酸钠与血内或血浆中的 Ca"t 结合形成难以离解的可溶性的枸橼酸钙，使血液中Ca"t减少，从而抑制凝血过程，产生抗凝作用，而且对红细胞有保护作用，，可防止溶血的发生。 文献报道测定枸橼酸盐的含量可采用的方法有 HPLC 法、RP-HPLC法等12，测定腺嘌呤的含量，可采用的方法有紫外分光光度法、HPLC法等3.4.在化学药品地方标准上升国家标准(第三册)，编号为 WS-10001-(HD-0230)-2002的 标准中，以用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇·磷酸盐缓冲液[取磷酸氢二钠(Na，HPO12H，0)4.5g，磷酸二氢钠 (NaH，PO 2H，0) 1.6g，，二二硫酸四丁基胺0.3g，加水900ml溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml](100：400)为流动相；检测波长为230nm。该法需要用到特殊试剂二硫酸四丁基胺，而且在该流动相条件下，腺嘌呤基本没有保留，同时枸橼酸容易拖尾等问题，从而影响结果的准确性。 本方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，磷酸二氢钠溶液-甲醇(90：10)作为流动相对枸橼酸和腺嘌呤同时进行含量测定。经验证，该方法精密度好、回收率较高。相较原来的方法，腺嘌呤保留更强，分离度好，试剂更经济环保，可应用于红细胞保存液中枸橼酸和腺嘌呤的同时含量测定。 仪器 结果与讨论 Thermo ScientificM DionexM UltiMate M 3000 SD 四元系统，包括： 色谱分离条件优化(不同有机相含量的影响) 不同有机相的比例为： -LGP-3400 SD 四泵分析泵(带在线脱气单元) 甲醇：磷酸缓冲盐(20：80)----图1 -WPS-3000 SL 自动进样器(配置100pl定量环) 甲醇：磷酸缓冲盐(10：90)----图2 - TCC-3000 RS 柱温箱(具备控温功能) 甲醇：磷酸缓冲盐(5：95)----图3 -DAD-3000 RS 器测器(检测池体积2.5uL) 20 CH3OH Thermo Scientific Dionex Chromeleon 色谱系统控制软件，版本6.80或以上 试剂与标准品 超纯水机 (Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC/UF xCAD plus，P/N： 50136146) 针式过滤器 (Fisher品牌，尼龙膜，孔径0.45 pm， P/N：CNG#431225) 甲醇(色谱纯， Fisher Chemical， P/N：A452-4)乙乙(色谱纯， Fisher Chemical， P/N：A998-4)磷酸二氢铵、腺嘌呤、枸橼酸均为色谱纯，购自阿拉丁。 图1.甲醇：磷酸缓冲盐(20：80)对照品色谱图 标准溶液的制备 腺嘌呤对照品溶液的制备：取腺嘌呤对照品约3.0mg，精密称定。置于25mL量瓶中，用流动相溶解稀释到25mL刻度，摇匀，即得。再用流动相稀释，得到0.12、0.024、0.012、0.0024、0.0012 mg/mL系列浓度的对照品溶液，直接进样，从而得到标准曲线。 枸橼酸对照品溶液的制备：取枸橼酸对照品约182.0mg，精密称定。置于25mL量瓶中，用流动相溶解稀释到25mL刻度，摇匀，即得。再用流动相稀释，得到7.28、1.456、0.728、0.1456、0.0728 mg/mL 系列浓度的对照品溶液，直接进样，从而得到标准曲线。 样品溶液制备 图2.甲醇：磷酸缓冲盐(10：90)对照品色谱图 精密量取红细胞保存液1mL，置于25mL量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。 色谱柱： Thermo Scientific Acclaim C18， 4.6×250 mm，5 pm，PN： 059149 流动相： CH，OH：25 mM磷酸二氢铵缓冲液(pH=2.5，用磷酸调节)=10：90 进样体积：5pL 流速：：11mL/min 柱温：30℃ 检测：紫外，入214nm 图3.甲醇：磷酸缓冲盐(5：95)对照品色谱图 精密度 取同一份对照品溶液，连续进样六次，腺嘌呤和枸橼酸的保留时间 RSD分别为：0.071%、0.085%；峰面积RSD分别为：0.363%、0.414%。 稳定性 取同一份供试品溶液，分别于0，1，2，6，12，24h进样10pL，腺嘌呤和枸橼酸的保留时间RSD分别为：0.277%、0.086%；峰面积RSD分别为：0.490%、0.143%。 线性关系考察 取预先配置的标准溶液，分别进样，记录腺嘌呤、枸橼酸的峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，作线性回归得到腺嘌呤盐的标准曲线为 Y= 243.9224X +0.1440(r=0.9953)，线性范围为0.0012~0.12 mg/mL；枸橼酸的标准曲线为Y=3.5095 X +0.0102 (r=0.99995)，0.0728~7.28 mg/mL。 最低定量限 以信噪比为10：1，测得腺嘌呤和枸橼酸的最低定量检测浓度为 0.00012 mg/mL、0.00728 mg/mL； 即 LOQ分别为0.6ng、36.4ng。 回收率 取红细胞样品，平行分成六份，每份加入等量的腺嘌呤和枸橼酸标准溶液，按照样品溶液制备方法，制成供试品溶液，腺嘌呤和枸橼酸的回收率分别为100.7%和95.7% 实际样品测定结果 取样品溶液，用0.22 pm滤膜过滤后，进样 表2.样品溶液测定结果 样品1 浓度 (mg/mL) 样品2 浓度 (mg/mL) 腺嘌呤 0.0095 腺嘌呤 0.0092 枸橼酸 0.8447 枸橼酸 0.8214 注：样品溶液是客户提供的QC样品，经过了高温消毒程序处理，因此可能导致腺嘌呤部分降解，本结果只标注QC样品溶液含量。 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：8008105118400 6505118(支持手机用户) 图4.红细胞保存液样品加标色谱图 结论 本实验采用 HPLC-UV红定红细胞保存液中腺嘌呤、枸橼酸含量；方法精密度、稳定性较好；操作简便、测定结果准确可靠、用时少、效率高、可用于红细胞保存液中腺嘌呤、枸橼酸含量测定。 ( l.王芳，耿建梅.用 RP-HPLC 法测定高渗枸橼酸盐腺嘌 呤-Ⅱ保存液中三种成分的含量，药学服务与研究， 2006，4：297-298. ) ( 2 . 董晓东，孙静，何颖.高效液相色谱法测定红细胞保存 液中枸橼酸及其钠盐总量，色谱， 2003，1：46-48. ) ( 3. 王伟，陶玉生，张淑琴.红细胞保存液中腺嘌呤含量 的紫外分光光度法检测，郑州大学学报：医学版， 2006，4：763-763. ) ( 4.李群代红姚英.高效液相色谱法测定红细胞添加剂中 腺呤的含量，中国 生 化药物杂志，2002，6：299-300. ) SCIENTIFIC SCIENTIFICAN_C_LC-      在较为早期的文献中，腺嘌呤也称为维生素B4。但是现在已经不再将其视为真正的维生素；属于B 群维生素的烟碱酸与核黄素，可以和与腺嘌呤组合成生物必需的辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。腺嘌呤是核酸的组成部分，在体内参与RNA 和DNA 合成，在实际应用中，腺嘌呤可提高血液在4℃贮存期间的活性水平，红细胞依赖腺嘌呤转变为磷酸腺苷(AMP) 并进一步磷酸化生成ATP 为红细胞新陈代谢活力提供高能化合物来源，大大延长血液在4℃的保存时间。