具抗菌活性胶囊剂中微生物限度检查方法及验证检测方案(微生物检测)

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维普资讯 http：//www.cqvip.com药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2006，26(9)—1328 具抗菌活性胶囊剂的微生物限度检查方法及验证 俞虹，凌明l，应佳，马安宇，叶群芳 (1.浙江省金华市药品检验所，金华321000；2.浙江普洛康裕药业有限公司，金华321000) 摘要 目的：建立抗菌活性类胶囊剂的微生物限度检查方法并对其进行验证。方法：抗生素胶囊，剪破胶囊壳，加冷的 pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液稀释，取不含胶囊壳的混悬液500 r· min离心5 min，离心后的上清液用膜过滤器进行薄膜过滤并用0.1%蛋白胨水溶液冲洗，薄膜置营养琼脂培养平板上培养。被稀释液浸润的胶囊壳用0.1%蛋白胨水溶液冲洗充分洗涤后，采用常规法测定其菌落数。结果：此方法有效地解决了这类胶囊剂的胶囊壳、辅料、水中未溶部分药物的前处理问题，并较为完全地消除了具有抗菌活性类胶囊剂对微生物限度检查的内在干扰。结论：该方法适合于具有抗菌活性的胶囊剂的微生物限度检查 关键词：抗生素胶囊济；微生物限度检查；前处理；验证 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2006)09-1328-04 Method and validation of the microbial limit testson capsules of antibacterial activity YU Hong'，LING Ming'，YING Jia，MA An-yu'， YE Qiong-fang’ (1. Jinhua Institute for Drug Control of Zhejiang Province，Jinhua 321000；2. Zhejiang Province Puluokangyu Pharmacy ltd，Jinhua 321000，China) Abstract(Objective：To provide a method of the microbial limit test on antibiotic capsule and to test the validationof the method. Methods： Take antibiotic capsules， break the capsule，add the cold pH 7.0 sodium chloride peptonesolution，put the solution of shell -less capsule into centrifugal tube(500 r· min). Extract the upper solution，Filter with the membrane filter and wash the filter with 0. 1% peptone solution washing liquid，Raise the thin -layerusing nutrition agar slab. The capsules soaked in the cold pH 7.0 sodium chloride peptone solution，and wash itcompeletly with 0.1% peptone solution washing liquid， determine the bacteria with dilute methods. Results： Thismethod effectively solve the problem of the front - dealing of capsule shell，supplementary material and the dissolvedmaterial in water ，and completely eliminated the disturbance in microbial limit test of it. Conclusion：This method issuitable for the microbial limit test on the cupsules of antibacterial active. Key words：antibiotic capsule；the microbial limit test；dispose；validation 1 仪器 HTY2000A型智能集菌仪(杭州泰林医疗器械厂)，偏聚氟乙稀滤膜(孔径0.45 um，上海亚东核级树脂有限公司)，LRH-250A 生化培养箱(广东医疗器械厂)，离心机等。 2 试剂与试液 营养肉汤培养基(041010)、营养琼脂培养基(050225)、玫瑰红钠琼脂培养基(050302)、改良马丁培养基(050110)，上述培养基均为北京三药科技开发公司产品；0.9%氯化钠溶液、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、0.1%蛋白胨水溶液由金华市药品检验所配制。磷酸二氢钾(上海试剂总厂，批号050318)、磷酸二氢钠(宜兴第二化学试剂厂，批号 050409)均为分析纯。蛋白胨(北京三药科技开发公司，批号050616)。 样品：头孢氨苄胶囊(批号20051101)、头孢拉定胶囊(批号20051103)、氨苄西林胶囊(批号20040506)。 对照菌株：大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]，以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。 2方法和结果 2.1 菌液的制备 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌3种菌种的新鲜培养物，分别接种 ( 第一作者 Tel(0579)3273612 ，13605797080；E-mail：yh708070@163. com ) 于10 mL营养肉汤培养基中，置37℃培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5~10-，使每 mL菌液中含50~100 CFU 备用。白色念珠菌接种于10mL改良马丁培养基中，置25℃培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-，使每mL菌液中含50~100 CFU 备用，黑曲霉的新鲜培养物接种于改良马丁琼脂斜面培养基中，25℃培养120 h，加0.9%无菌氯化钠溶液3 mL，将孢子洗脱，洗液用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 mL 菌液中含孢子数50~100 CFU 孢子混悬液备用。 2.2 稀释液和冲洗液的制备取pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液21，灭菌后冷藏，作为稀释液备用。取0.1%蛋白胨水溶液(调节pH7.1)灭菌，作为冲洗液备用，用前水浴加热至30℃。 2.3 供试液的制备 称取样品各10 g，剪破胶囊壳，加冷的pH7.0氯化钠蛋白陈缓冲液至100 mL，摇匀，取不含胶囊壳的混悬液至离心机中500 r· min-'离心5 min，取上清液作为供试液a. 2.4 取上述已在稀释液中膨胀的胶囊壳置干热灭菌的烧杯中，用0.1%蛋白胨水溶液500mL(每次30mL)充分搅拌洗涤，加45℃pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL 使溶，作为供试液b。 2.5 验证方法21 (1)试验组a：先取供试液a10mL加入到200 mL 的0.1%蛋白胨水溶液中，摇匀后用薄膜过滤器进行薄膜过滤(滤前滤膜先用冲洗液浸润)，并取0.1%蛋白胨水溶液1000 mL逐次进行冲洗(每次50 mL蠕动泵转速80r· 液各1 mL，薄膜分别置琼脂培养平板及改良马丁培养平板上培养，按薄膜菌落计数；(2)试验组b：取供试液b10 mL加入上述5种备用菌液各1mL分别置琼脂培养平板及改良马丁培养平板上培养，测定其菌落数。(3)活菌组：取上述5种备用菌液各1mL，加人到200 mL 的0.1%蛋白胨水溶液中摇匀后用薄膜过滤器进行薄膜过滤，薄膜置营养琼脂培养平板上培养，测定所加的试验菌数。(4)供试品对照组：测定供试液本底菌数。(5)稀释液组：为考察供试液制备过程中微生物受影响的程度，用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液替代样品按供试液的制备同法制备成空白液，并取0.1%蛋白胨水溶液1000 mL 逐次进行冲洗(每次50 mL蠕动泵转速80 r·min~)，最后50mL冲洗时加入上述5种备用菌液各1 mL，薄膜分别置琼脂培养平板及改良马丁培养平板上培养，测定其菌落数。同法进行3次独立的平行试验。 2.6 回收率计算试验组细菌回收率(%)=[1/2(试验组a菌落数+试验组b菌落数)-供试品对照组平均菌落数]+活菌组平均菌落数×100%；稀释液组细菌回收率(%)=稀释液组平均菌落数：活菌组平均菌落数×100% 2.6.1 冲洗液用量的验证 取供试液a及稀释液各10 mL 分别用0.1%蛋白胨冲洗液600，800，1000，1200 mL，同法置薄膜过滤器进行薄膜过滤并逐次冲洗后，加入上述5种备用菌液各1mL测定，结果见表1。 表1 试验组a不同冲洗量各细菌回收率(%) Tab 1 Different flushing quantity various bacteria recovery( %) in trying group a 冲洗量 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 (flushing quantity) (escherichia coli) (staphylococcus aureus) (bacillus subtillis) (candida albicans) (aspergillus niger) /mL A B C A B C A B C A B C A B C 600 75.3 62.4 70.0 65.2 76.3 75.0 71.2 70.3 69.3 79.3 89.9 96.5 97.3 95.6 89.7 800 75.1 78.3 73.3 86.1 78.9 86.1 72.3 76.3 76.0 85.6 95.9 93.1 91.3 96.3 92.1 1000 88.3 86.8 86.9 89.7 91.0 89.3.84.3 85.6 88.3 98.0 93.2 95.1 96.0 93.6 96.3 1200 85.1 90.6 91.6 90.3 90.6 91.2 85.9 82.0 85.2 91.0 90.9 99.1 98.3 93.6 95.3 注：A.头孢氨苄胶囊；B.氨苄西林胶囊；C.头孢拉定胶囊 Notes：A. cefalexin capsulesB. amoxillin capsules C. cefradine capsules 2.6.2 胶囊壳的验证 取供试液 b10 mL加入各菌液1mL分别置琼脂培养平板及改良马丁培养平板上培养，测定其菌落数，结果见表2。 2.6.3 稀释液的验证取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100 mL，并取0.1%蛋白胨水溶液1000 mL逐次进行冲洗(每次50 mL)，最后50 mL 冲洗时加入 上述5种备用菌液各1mL，测定其菌落数。结果见表3. 2.6.4 称取供共品各10 g，剪破胶囊壳，加冷的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，摇匀，取不含胶囊壳的混悬液至离心机中500 r·min离心5min"，取上清液按薄膜过滤法操作，取上述已在稀 表2试验组b细菌回收率(%) Tab B2acterium recovery in trying group b 供试品 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 (sample) (escherichia coli) (staphylococcus aureus) (bacillus subtillis) (candida albicans) (aspergillus niger) A 83.9 87.1 86.7 96.3 93.2 B 88.2 80.1 82.1 90.2 93.6 C 80.6 82.3 85.1 90.9 94.0 注：A.头孢氨苄胶囊；B.氨苄西林胶囊；C.头孢拉定胶囊 Notes： A. cefalexin capsules B. amoxillin capsules C. cefradine capsules 表3稀释液的验证结果(对照组) Tab 3 Diluent confirmation result(comparison group) 菌种 加人菌数(活菌数) [joins the fungus number 回收菌数 回收率/% (mold mushroom spawn) (the viable count)] (recycling fungus number) (recovery) 大肠埃希菌(Escherichia coli) 102 89 87.5 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 78 76 97.4 枯草芽孢杆(Bacillus subtillis) 52 49 94.2 白色念珠菌(Candida albicans) 61 58 95.1 黑曲霉(Aspergillus niger) 53 52 98.1 释液中膨胀的胶囊壳，用0.1%蛋白胨水溶液500mL(每次30mL)充分搅半洗涤，加45℃ pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL使溶，按常规法 操作；加人上述5种备用菌液各1mL分别置琼脂培养平板及改良马丁培养平板上培养，测定两者菌落数的平均值。供试品的验证结果见表4。 表4供供品品细菌平均回收率(%) Tab 4Bacterium average recovery in trying group 供试品 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 (sample) (escherichia coli) (staphylococcus aureus) ( bacillus subtillis ) (candida albicans) (aspergillus niger) A 86.3 89.3 87.2 98.1 96.9 B 90.7 89.4 89.5 99.3 99.6 C 85.3 88.7 86.6 98.6 97.5 注：A.头包氨苄胶囊；B.氨苄西林胶囊；C.头孢拉定胶囊 空白的菌落数均为0个/mL。 3 结果与讨论 3.1 具有抗菌活性的胶囊剂是应用极为广泛的品种，建立其微生物限度检查方法并对方法进行验证对制剂生产过程中的质量控制有着极其重要的意义。从表1可看出：冲洗量达800 mL时细菌回收率均已在70%以上，该方法可达到较为满意的效果；表2显示稀释剂(对照组)菌回收率也均在70%以上，按2005年版中国药典规定菌回收率均须达到70%以上才符合验证要求，本方法符合验证要求。为避免操作上的个体差异，笔者建议选用1000 mL的冲洗量较为合适。 3.2 如表4所示 具抗菌活性的胶囊剂通过本法能达到满意的验证效果。胶囊剂多含有水溶性和非水溶性的敷料及能溶于45℃稀释剂的胶囊壳，只有剪破胶囊壳用冷稀释液使内容物分散在溶剂中而胶囊保持原状，才能解决过滤难、离心难等问题，胶囊壳部分通过充分洗涤后采用常规法操作是可行的； 另外使用冷藏过的稀释液有利于降低抗生素的溶出，冲洗时将冲洗液加热至30℃可加快抗生素的洗脱，从而一定程度上减少了冲洗液的用量。 3.3 这类抗生素制剂即使存在微量的情况下也均有非常强的抗菌活性，笔者曾多次用培养基稀释法、离心法或中和法试验均无法消除其内在干扰。本法采用离心加薄膜过滤，在冲洗量小于600 mL时仍存在较大的干扰；取供试液加人到冲洗液中稀释的量以200 mL 为佳，这样抗生素的浓度相对较低；过滤前滤膜要先用冲洗液浸润，避免滤膜对抗生素的过多吸附。 ( 参考文献 ) ( 1S SONG Qin(宋勤)， YUAN Lin - na(袁林娜)，LIU Ying-xu(刘应 旭). A method for microbial limit tes t s of cefradine(口服头孢拉定 制剂微生物限度检查研究试验). Chin J Pharm Anal(药物分析杂 志).2005，25：6 ) ( 2 ChP(中国药典).2005.Vol Ⅱ(二部)：Appendix(附录)94(本文于2006年1月23日收到) )