乙酰螺旋霉素片中微生物限度检查检测方案(微生物检测)

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维普资讯 http：//www.cqvip.com国际医药卫生导报2007年 第13卷 第02期(半月刊) 乙酰螺旋霉素片微生物限度检查方法的研究 肖文莉 吴美香 郴州市药品检验所 湖南郴州 423000 摘 要 目的建立一种测定乙酰螺旋霉素片微生物限度检查的方法。方法采用《中国药典》2005年版二部附录收载的方法。结果通过试验，采用离心集菌薄膜过滤法，能够排除乙酰螺旋霉素自身的干扰。结论该法简单易行，重现性好，值得推广使用。 关键词 乙酰螺旋霉素 微生物限度检查 中图分类号：R978.1*5 文献标识码：A 文章编号：1007-1245(2007)02-0082-04 乙酰螺旋霉素为螺旋霉素的乙酰化衍生物，属16元环大环内酯类，对金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌和化脓性链球菌，粪肠球菌等革兰阳性球菌具有良好的抗菌作用，对产气荚膜杆菌，淋病奈瑟菌，衣原体属，支原体属等具有抑制作用。本文作者通过试验，确定了其微生物限度检查应采用离心集菌薄膜过滤法，该法能够排除其本身对微生物生长的干扰。该方法简便易行，重现性好，值得推广使用。 1试验材料 1.1试验样品乙酰螺旋霉素片 批号：20060204厂家：岳阳中湘康神药业集团有限公司 主要成分：本品为单乙酰螺旋霉素II、单乙酰螺旋霉素III、双乙酷螺旋霉素II、双乙酰螺旋霉素III四个组分为主的混合物。 1.2实验菌株金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B) 44105]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC (F)98001]， 黑曲霉[CMCC(F)98003]，来源：由中国药品生物制品检定所提供 1.3试药 1.3.1 培养基名称及批号 营养肉汤培养基：050603；玫瑰红钠琼脂培养基：040701：营养琼脂培养基：050106；胆盐乳糖培养基：050420；改良马丁琼脂培养基：050808； pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：050824；0.1%蛋白胨水溶液：050711。 以上培养基均由：北京三药科技开发公司生产；中国药品生物制品检定所监制。 1.4滤器类型：HTY反复使用集菌过滤器：泵管：FPD220 批号：20060901；微孔滤膜：孔径：0.45m，尺寸：中50mm； 均由杭州泰林生物技术设备有限公司提供；HTY-200集菌仪：杭州高得医疗器械有限公司、杭州泰林医疗器械厂提供。 1.5菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌新鲜培养物接种至营养肉汤中，培养24小时，白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基 中，培养24小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu 的菌悬液，备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5m10.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成1m1含孢子数为50~100Ccfu 的孢子悬液，备用。 2.方法与结果 2.1常规法 2.1.1供试液制备：取本品制成1：10的供试液，备用。 2.1.2试验组：取1：10的供试液1ml于培养皿中再依次加入已知菌数的试验验各1m1。按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定菌落数。 2.1.3菌液组：按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定每1ml中菌落数。除不加供试液操作同试验组 ，2.1.4供试品对照组：取1：10的供试液1ml分别注入平皿中按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定本品的本底数。 2.1.5稀释剂对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1m1，加入已知菌数的试验菌1ml，按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定菌落数。 2.1.6菌回收率计算 试验组平均数一供试品对照组平均数 试验组的菌回收率(%)=：菌液组的平均菌落数稀释剂对照组平均菌落数稀释剂对照组回收率(%)=菌液组的平均菌落数 2.1.7结果判断：见表1。 从上述结果可以看出：在两次独立的平行试验中，采用常规法检验乙酰螺旋旋素片，人工加入5种菌液，稀 表1 菌种 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽杆菌 白色念珠菌 黑曲每 试验次数 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 实验结果试验组菌落数 38 26 10 5 48 39 87 61 49 69 菌液组菌落数 87 68 92 54 98 79 94 78 57 79 供试品对照组菌落数 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 稀释剂对照组菌落数 81 73 85 51 88 65 89 71 63 72 稀释剂对照组回收率 93.1% ：107.4% 6 92.4% 94.4% 89.8% 82.3% 94.7% 91.0%110.5% 91.1% 试验组回收率 43.7% 38.2% 610.9% 9.3% 49.0% 49.4% 92.6% 78.2% 86.0% 87.3% 表2培养基稀释法验证试验回收率结果表 菌种 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 试验次数 1 2 1 2 1 2 实验结果 试验组菌落数 37 41 14 17 25 21 菌液组菌落数 73 74 70 55 96 88 供试品对照组菌落数 0 0 0 0 0 0 稀释剂对照组菌落数 71 65 68 49 87 69 稀释剂对照组回收率 97.3% 87.8% 97.1% 89.1% 90.6% 78.4% 试验组回收率 50.7% 55.4% 20.0% 30.9% 26.0% 23.9% 表3薄膜过滤法验证试验回收率结果表 菌种 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 试验次数 1 2 1 2 1 2 实验结果 试验组菌落数 38 43 39 27 49 46 菌液组菌落数 70 3 73 51 78 81 供试品对照组菌落数 0 0 0 0 0 0 稀释剂对照组菌落数 59 63 81 60 77 64 稀释剂对照组回收率 84.3% 86.3% 111.0% 117.6% 98.7% 79.0% 试验组回收率 54.3% 58.9% 53.4% 52.9% 62.8% 56.8% 表4离心集菌薄膜过滤法验证试验回收率结果表 菌种 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 试验次数 1 2 1 2 1 2 实验结果 试验组菌落数 64 67 61 49 66 73 菌液组菌落数 70 73 73 51 78 81 供试品对照组菌落数 0 0 0 0 0 0 稀释剂对照组菌落数 59 63 81 60 77 64 稀释剂对照组回收率 84.3% 86.3% 111.0% 117.6% 98.7% 79.0% 试验组回收率 91.4% 91.8% 83.6% 96.1% 84.6% 90.1% 释剂对照组的回收率均高于70%，说明稀释剂对测定无干扰；白色念珠菌和黑曲霉的回收率均高于70%，说明乙酰螺旋霉素片的霉菌和酵母菌数测定可以采用常规法测定。其余细菌的回收率低于70%，说明乙酰螺旋每素片对细菌有不同程度的抑菌活性，应建立新的方法消除供试品的抑菌活性并重新验证。 2.2培养基稀释法 2.2.1菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌新鲜培养物接种至营养肉汤中，培养24小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液，备用。 2.2.2试验组：取1：10的供试液1ml分别注入 5个平皿中，使成0.2ml/m，再依次加入已知菌数的试验菌。按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定菌落数。 2.2.3菌液组：按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定每1ml 中菌落数。 2.2.4供试品对照组：取1：10的供试液1ml分别注入5个平平中，使成0.2ml/皿，按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法则定本品的本底数。 2.2.5稀释剂对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，加入已知菌数的试验菌1ml，按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定菌落数。 2.2.6结果判断：见表2. 从上述结果可以看出：在两次独立的平行试验中，采用培养基稀释法检验乙酰螺旋霉素片，人工加入3种菌液，稀释剂对照组的回收率均高于70%，说明稀释剂对测定无干扰；试验组的回收率均低于70%，不符合验证试验，说明乙酰螺旋霉素片经培养基稀释后仍不能消除其抑菌活性，应建立新的方法消除供试品的抑菌活性并重新验证。 2.3薄膜过滤法 2.3.1试验组：取1：10的供试液1ml，加入置有100ml定量稀释液的滤器中，经薄膜过滤后，用0.1%蛋白胨水溶液冲洗5次(100ml/次)，在最后一次冲洗液中，加入规定的定量活菌50~100cfu， 抽滤，取膜，按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定菌落数。 2.3.2 菌液组：除不加供试液外，操作同试验组。按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定每1ml中菌落数。 2.3.3供试品对照组：除不加菌液外，操作同试验组。按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定本品的本底数。 2.3.4稀释剂对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml， 其余同试验组， 按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定菌落数。 2.3.5结果判断见表3 从上述结果可以看出：在两次独立的平行试验中，采用薄膜过滤法检验乙酰螺旋霉素片，人工加入3种菌液，稀释剂对照组的回收率均高于70%，说明稀释剂对测定无干扰；试验组的回收率均低于70%， 符合验证试验，说明经薄膜过滤后仍不能完全消除乙酰螺旋霉素片的抑菌活性，因此，重新建立方法并并证。 2.4离心集菌薄膜过滤法 2.4.1试验组取1：10的供试液10ml于500转/分离心5分钟，量取上清液， 1ml，加入置有100ml定量稀释液的滤器中，经薄膜过滤后，用0.1%蛋白胨 水溶液冲洗5次(100ml/次)，在最后一次冲洗液中，加入规定的定量活菌50~100cfu，抽滤，取膜，按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定菌落数。 2.4.2菌液组除不加供试液外，操作同试验组。按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定每1ml中菌落数。 2.4.3供试品对照组除不加菌液外，操作同试验组。按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定本品的本底数。 2.4.4稀释剂对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml， 其余同试验组， 按《中国药典》2005年版微生物限度菌落计数方法测定菌落数。 2.4.5结果判断；见表4 从上述结果可以看出：在两次独立的平行试验中，采用离心集菌薄膜过滤法检验乙酰螺旋霉素片，人工加入3种菌液，稀释剂对照组的回收率均高于70%，说明稀释剂对测定无干扰；试验组的回收率均高于70%，符合验证试验，说明经离心集菌薄膜过滤后可消除乙酰螺旋霉素片的抑菌活性，因此，离心集菌薄膜过滤可用于乙酰螺旋霉素片的微生物限度检查。 3控制菌检查方法的验证 3.1试验组取1：10的供试液10ml于500转/分离心5分钟，量取上清液1ml，加入置有100ml定量稀释液的滤器中，经薄膜过滤后，用0.1%蛋白胨水溶液冲洗5次(100m1/次)，在最后一次冲洗液中，加入10~100cfu·m11大肠埃希菌菌液1ml。抽滤，取膜，入增菌培养基。 3.2 阴性菌对照组方法同试验组，加入10~100cfu·ml-金黄色葡萄球菌菌液1ml代替大肠埃希菌。 3.3结果试验组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌。 4 讨论 根据验证试验结果，确定乙酰螺旋霉素片的微生物限度检查法为： 4.1细菌数及控制菌检查可采用离心集菌薄膜过滤法测定。方法如下： 取本品 10g， 加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，摇匀，使成1：10供试液，于500转/分离心5分钟，量取1ml， 加入置有100ml定量稀释液的滤器中，经薄膜过滤后，用0.1%蛋白胨水溶液冲洗5次(100m1/次)，照《中国药典》2005年版二部微生物限度检查法项下离心集菌薄膜过滤法进行检查。 4.2霉菌和酵母菌数可采用常规法测定。方法如下：取本品10ml， 加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，摇匀，使成1：10供试液，照《中国药 典》2005年版二部微生物限度检查法项下常规法进行检查。 4.3从表1、表2可以看出，金黄色葡萄球菌为其敏感菌株，对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌也有不同程度的抑菌作用。白色念珠菌及黑曲每的回收率均在70%以上，说明乙酰螺旋霉素片对霉菌和酵母菌生长没有影响，故霉菌和酵母菌检查可以采用常规法。从表3可以看出，离心集菌薄膜过滤法可以消除乙酰螺旋素片的抑菌作用。 4.4在选择薄膜过滤法的冲洗量时，如果冲洗量较大，会使细菌菌体受损，不利于生长，直接影响到回收率，同时量多的冲洗液也会影响滤膜孔径，使滤膜受损，影响实验结果的准确性。反之，如果冲洗量较小，样品的抗菌作用未消除，回收率无法达到70%。因此，此 样品选择冲洗500 ml冲洗液为宜，实验菌才能生长良好。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 中国药典(二部)[S].北京：北京工业出版社，2005， ) ( [2] 中国药典(二部)[S].北京：北京工业出版社，2005， 附录：93 ) ( [3]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京： 科学出版社，2000：61 ) ( 收稿日期：2006-11-26 )