拈痛丸中盐酸小檗碱的含量检测方案(毛细管电泳仪)

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中药材 Joumnal of Chinese MedicinalMaterials 第30卷第8期2007年8月·1035· ( 参 考 文 献 ) ( [1]罗晋萍，张中苏，田晨.高效液相色谱法测定桂龙咳喘 宁胶囊中肉桂酸的含量.药物分析杂志，2000，20(3)： 200-201 . ) ( [2]李 静，朱日然，李启艳，等.HPLC法测定养心定悸口 服液中肉桂酸的含量.实用 医 技杂志，2005，11(12)： 3251-3252. ) ( [3]李颖，阳长明.反相高效液相色谱法测定胸舒颗粒剂中 ) ( 肉桂酸的含量.湖南中医杂志，2000，16(3)：70. ) ( [4]徐向阳，张蕙，陈希.HPLC法测定脉络宁口服液中肉桂酸的含量.江苏药学与临床研究，2003，11(1)：14-16. ) ( [5]徐向阳，张蕙，陈希 .RP-HPLC法测定利咽灵片中肉桂 酸的含量.药物分析杂志，2005，25(2)：235-236. ) ( [6]黄晓红，宋宗毕，李秀琴，等 .RP-HPLC测定苓桂术甘方 中肉桂酸的含量.中成药，2002，24(10)：764-766 ) ( (2006-12-19收稿) ) HPCE法定定拈痛丸中盐酸小檗碱的含量 汤佩莲，龚红全，宋粉云 (广东药学院，广东广州510224) 摘要 目的：建立拈痛丸中盐酸小檗碱含量测定的毛细管电泳法。方法：采用毛细管区带电泳和紫外检测模式测定，电泳条件：60 mmol/LNaHPO4溶液甲醇(6535)为电泳介质，未涂层弹性融硅石英毛细管柱(46 cm X50um)为分离通道，重力方式进样，室温下 27 kV恒压电泳分离，335 mm紫外检测。结果：盐酸小檗碱在4.95~59.4ug/ml浓度范围内线性关系良好，平均回收率为101.1%，方法精密度(RSD)为2.75%(n=6)。结论：该法可用于拈痛丸中盐酸小檗碱的含量测定。 关键词拈痛丸；盐酸小檗碱；毛细管电泳法；含量测定 中图分类号：R286.02 文献标识码：A 文章编号：1001-4454(2007)08-1035-02 拈痛丸为香港注册的中药成方制剂，由广蕾香、延胡索、厚朴、黄连等18味中药制成，具有解表化湿，理气和胃，燥湿除满，温中止痛之功效。临床用于治疗外感风邪，湿滞困阻所致的恶寒发热，腹痛吐泻，头晕目眩，身体上下诸痛；兼治因寒湿气滞所致的脘腹胀痛，不思饮食。中国药典(2005年版)一部附录中新增加了毛细管电泳法(HPCE)，使其成为中药含量测定的法定方法，但尚未有以毛细管电泳法进行含量测定的品种。本实验采用毛细管区带电泳法测定拈痛丸中盐酸小檗碱的含量，简便、快捷、经济，可用于拈痛丸的质量控制。 仪器和试药 CL1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，德国 KNAUER K-2510紫外可见检测器，HW-2000色谱工作站2.17版(南京千谱软件有限公司)。DL-360超声波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂)，工作频率4.5KHz ±5%，输出功率240W。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(50um D，总长54 cm，有效长度46 cm，河北锐年永沣色谱器件有限公司)。 ( 基金项目：广东省自然科学基金资助项目(No.5002841) ) ( 作者简介：汤佩莲，主管药师，主要从事医院药学工作。 ) ( 通讯作者：宋粉云。 ) 盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，110713-200208)；痛丸(中港药业公司，每包1g，每盒12包)；Na HPONaOH、甲醇等均为分析纯，水为二次蒸馏水。 2 实验部分 2.1 溶液的制备 2.1.1 .缓冲液：取NaHPO适量配制60mmol/I贮备液。临用时配成60 mmol/L Na HPO4溶液甲醇(6535)的电泳介质。 2.1.2 对照品溶液的制备：精密密取在100℃干燥5h的盐酸小檗碱对照品19.8mg，置200 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(盐酸小檗碱浓度为99ug/ml). 2.1.3 供试品溶液的制备：取对痛丸样品10包，研碎，取约1.5 g，精密称定，置100ml量瓶中，加入盐酸甲醇(1：100)约 95 ml， 60℃水浴中加热15min，取出，超声处理 30min，室温放置过夜，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液0.45pn滤膜过滤，作为供试品溶液。 2.1.4 阴性对照液的制备：取处方组成中除黄连 外的其余成分制成不含黄连的阴性对照品，按“2.1.3"项下的制备方法处理得阴性对照液。 2.2 电泳条件 以60 mmol/L Na HPO溶液甲醇(6535)为电泳介质，未涂层弹性融硅石英毛细管柱(46 cm X50 {m)为分离通道。采用重力方式进样，进样时间为10s.室温下 27kV恒压电泳分离，335 nm 紫外检测。毛细管柱在使用前依次用0.1mol/L NaOH溶液、水、电泳介质各冲洗约 5min。每二次进样间用电泳介质冲柱2min。当基线不稳，出小杂峰时更换缓冲液，换后电平衡5min左右。在此条件下，盐酸小檗碱的保留时间约为4.2min. 2.3 方法学考察 2.3.1 标准曲线制备：分别吸取一定量的盐酸小檗碱对照品贮备液，加甲醇稀释成盐酸小檗碱浓度为4.95、9.9、19.8、29.7、39.6、49.5、59.4ug/ml的溶液。依次进样10s，每个浓度测定3次以上。以峰高(A)对对照品溶液系列浓度(C)进行回归，得盐酸小檗碱回归方程A=-8.32+56.48C，相关系数r=0.9994。表明盐酸小檗碱浓度在4.95~59.4ug/ml之间与峰面积线性关系良好。 2.3.2 精密度试验：取浓度为29.7ug/ml的盐酸小檗碱对照品溶液进样10s，连续测定5次，其峰高的平均值为1640，RSD 为 2.18%，表明仪器精密度良好。 2.3.3 稳定性试验：取供试品溶液(CK20060201)在 0，2，4，6，8h分别进样10s，记录峰高，结果盐酸小檗碱峰高的 1677，RSD为 2.72%，表明供试品溶液在8h内稳定。 2.3.4 重复性试验：取同一批号(CK20060201)样品6份，照“2.1.3”方法提取、测定，结果盐酸小檗碱平均含量为1.988 mg/g， RSD 为 2.75%。表明分析方法精密度良好。 2.3.5 加样回收试验：精密称取同一批号样品(CK20060201)共6份，加入相应量的盐酸小檗碱对照品，照“2.1.3"方法处理并测定，计算回收率，结果见表1.盐酸小檗碱平均回收率为101.1%，RSD=2.93%。结果表明本方法准确可靠。 2.4 样品测定 取拈痛丸样品3批，照“2.1.3”方法制备供试品溶液，分别取对照品溶液(29.7pg/ml与供试品溶液各进样10s，测定，计算样品中盐酸小檗碱的含量，并与 HPLC法含量测定结果相比较，结果见表1. 表 1 样品测定结果(n=3) 批号 HPCE HPLC 盐酸小檗 RSD 盐酸小檗 RSD 碱含量 碱含量 (%) (%) (mg/g) (mg/g) CK20060201 1.988 2.75 1.914 0.85 CK20060701 1.965 2.13 2.208 1.34 CK20060801 1.975 2.69 2.063 0.72 讨论 3.1 缓冲溶液的选择 选用60 mmol/L Na HPO为电泳介质，电流过大，加有改性剂甲醇减少了电流；并且改善了峰形，所以最后确定为60 mmol/LNaHPO溶液甲醇(6535)为电泳介质。 3.2 进样时间的影响 采用虹吸法，在一定的进样高度下，进样时间决定了进样量。进样量太少，达不到检测器的灵敏度；进样量太大，样品塞长度超过扩散引起的区带增宽，而且大量的溶剂甲醇引起基线的不稳定。本实验进样时间为5s时峰高较小，大于 10s时容易断流，所以最后确定为重力进样10s. 3.3 测定波长的选择 在乙醇中，小檗碱在225mm、270 nm、335 mm三个波长处有最大吸收，在同一缓冲体系下三个波长同时测定，得出335nm时同一溶液灵敏度最高，所以选择335mm为测定波长。 3.4 提取方法的确定 采用盐酸甲醇(1100)为溶剂，分别超声提取20、30、40、50、60 min，结果表明 30min即可提取完全，所以选择超声时间为30m in. 3.5 HPCE与 HPLC法测定结果的比较 同一样品，同时采用 HPCE和 HPLC进行含量测定，表1结果表明，两方法的含量测定结果无显著差异。但HPLC法分析时，盐酸小檗碱的保留时间约为21.8m in； HPCE法分析时其保留时间仅为5.4min，显然采用 HPCE法可大大缩短分析时间。比较两方法的RSD(%)，显然 HPCE法的重现性比 HPLC法差，可能是由其进样的重复性决定的。 ( 参 考 文 献 ) ( [1]张国华，王延琮，张永友，等.高效毛细管电泳测定黄连及成药中小檗碱型生物碱的含量.色谱，2005，13(4)： 247-249. ) ( [2]国家药典委员会.中华人民共和国药典.2005年版.一部.北京：化学工业出版社，2005：380-381. ) ( (2007-03-29收稿) ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved http：//www.cnki.net