止咳露中麻黄碱和可待因检测方案(毛细管电泳仪)

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分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第28卷第3期2009年3月Vo1.28.No.32009-3 第28卷第3期2009年3月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVo1.28.No.32009-3 胶束扫集毛细管电泳快速测定止咳露中的麻黄碱和可待因 李斯光'，李利军*2程 昊，蔡 卓 (1.广西大学化学与化学工程学院，南宁530004；2.广西工学院生物与化学工程系，柳州545006) 摘 要：采用胶束扫集毛细管电泳，建立了快速测定止咳露中麻黄碱和可待因含量的方法，并通过日间实验、柱间实验等对方法的稳定性进行了考察研究。胶束扫集电动色谱缓冲体系含 60 mmol/L 十二烷基磺酸钠，10 mmol/L NaH PO4(pH2.20)，18%乙腈(V/V)，分离电压-14kV，测量波长200 nm。讨论了pH、SDS浓度、样品溶剂等对分离效果的影响。在优化条件下，麻黄碱和可待因均在5min 内出峰，方法检出限(ug/mL)、线性范围(ug/mL)、相关系数分别为：麻黄碱0.433、1.73~27.7、0.9997，可待因0.833、3.33~50.3、0.9996，回收率在96.7%~103.5%之间。峰面积日内 RSD ≤4.2%(n=5)，日间 RSD ≤8.0%(n=5)，柱间实验 RSD <.3%(n=3)。 关键词：毛细管电泳；胶束扫集；麻黄碱；可待因 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2009)03-070-04 毛细管电泳(CE)具有高效、快速、微量、多模式、经济、自动化及洁净等优点，在化学、生命科学、临床医学、药学等领域得到了广泛的应用。但相比液相色谱，CE 仍存在稳定性、灵敏度较差，难以用于制备等缺点。其中灵敏度问题已有多种解决方法，包括应用高灵敏度检测器、使用在线富集技术等；稳定性则与仪器、毛细管柱性能及环境等有关，相关研究报告较少。 本文采用胶束电动色谱法，以止咳露中的麻黄碱、可待因两种成分为测量对象，通过日间实验，柱间实验等，对毛细管电泳的稳定性进行了考察及初步研究，结果表明，在优化的条件下，胶束电动色谱的出峰时间、峰高、峰面积均有较好的重复性，峰面积日内 RSD<4.2%，日间 RSD<8.0%，柱间RSD<2.3%。可见影响毛细管电泳法稳定性的主要因素为实验操作误差。对于胶束扫集电动色谱，同一批柱子之间，更换毛细管柱对测定结果的重现性无显著影响。同时，与区带毛 细管电泳法相比，胶束扫集提高了检测灵敏度4，5]。 可待因、麻黄碱等是珮夫人止咳露、联邦止咳露等多种止咳药中的有效成分，但是这两种药物的滥用会造成药物依赖性，严重可导致用药者精神崩溃，作出极端行为。因而对这些药物的管理很重要，测定其中可待因、麻黄碱的含量具有重要意义，已报道的方法有高效液相法61、毛细管区带电泳法等，本文使用胶束扫集电动色谱法，对市售止咳露中的麻黄碱及可待因进行测定。 实验部分 1.1 仪器与试剂 ACS2000型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器公司)，负高压电源，未涂层熔融石英毛细管中50 pm X40.0 cm，有效长度23.5 cm。检测波长200 nm。UV-2102PC型紫外-可见分光光度计(美国UNICO 仪器公司)； DL-60D 超声波清洗器(上海之信仪器公司)； Mettler toldedo Delta 320 型酸度计 ( * 收稿日期：2008-03-01；修订日期：2008-05-21 ) ( 基金项目：广西自然科学基金(桂科自0481019)项目资助 ) ( 作者简介：李斯光(1980-)，男，硕士研究生； Email： lilijun0562 @sina. com ) (瑞士梅特勒托利多公司)。 磷酸可待因、盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所)； NaH PO4、HPO4、乙腈；十二烷基磺酸钠(SDS)。所有试剂均为分析纯。水为重蒸水。复方磷酸可待因口服液(市售)。 1.2 实验方法 分别准确称取盐酸麻黄碱10.0 mg，磷酸可待因10.4mg，用甲醇配制成400、416 ug/mL 对照品贮备液，置冰箱44℃保存。缓冲液均用100 mmol/LNaH，PO4、200 mmol/L SDS 储备液配制，pH用H，PO4(17+3)调节。所有溶液进入毛细管前均用0.45um 滤纸过滤，超声脱气。 按照文献的方法预处理毛细管，实验前依次用1mol/LNaOH溶液、水、缓冲液冲冼 10 min。胶束扫集法：重力进样时间20s(H=9.0cm)，迅速采用14kV进行分离。 日内实验：对1份标准样品，连续测定5次。日间实验：配制标准样品溶液，等分成5份，每天定时取一份测定1次。连续测定5天，对5个数据进行统计。柱间实验：截取等长毛细管柱3根(同一批次)，使用同一标准样品每根柱子连续测定5次，取平均值。对所得3个平均值进行统计。 2 结果与讨论 2.1 有机改性剂的选择及浓度优化 实验了甲醇、乙腈、异丙醇，乙醇等有机改性剂，结果表明，4种有机改性剂均能不同程度的改善峰形，但使出峰时间延长，其中乙腈具有较好的分离度和最短的出峰时间。因而选择乙腈为改性剂。并试验了缓冲溶液当乙腈为10%~25%(V/V)时的分离情况及出峰时间，发现随乙腈含量增加，两被测物的分离度增大，但出峰时间延长，峰变宽，当乙腈为18%时，分离度、峰形均较理想，出峰速度快，均<5 min。实验选定乙腈的体积分数为18%(V/V)。 2.2 缓冲体系的选择 为抑制电渗流，本实验选用磷酸盐缓冲体系，并分别考察了pH为2.00、2.20、2.40、2.60、2.80时麻黄碱和可待因的出峰情况，结果表明，不同的pH对两种被测物的分离度影响不大，但对出峰时间的稳定性有较大的影响。出峰时间稳定性在pH2.20 时最好，pH偏离2.20时，稳定性变差，因而实验选定缓冲体系的pH为2.20。 2.3 SDS 浓度的选择 考察了 SDS 浓度为20、40、60、80、100mmol/L时可待因和麻黄碱的出峰情况。当 SDS 浓度增加时，峰增高，出峰时间缩短。这可由方程K=K(Vps/Vag)解释。其中r是保留因子，K是分配系数，Vps为胶束的体积，Vag为溶剂体积。可见SDS浓度增大，K值增大，样品与胶束的作用增强，因而峰增高，且出峰时间缩短。但是 SDS 浓度的增高也会使 SDS 形成的堆积区宽度增大，引起峰增宽。本实验在 SDS达100 mmol/L时，出现峰增宽变低的现象。 虽然在 SDS 为 80 mmol/L时，具有最高的峰高，但电流也较大，基线稳定性不如60 mmol/L时，为保证实验稳定性，选择 SDS的浓度为60mmol/L. 2.4 分离电压选择 实验了电压为10、12、14、16、18 kV 时对峰高及出峰时间的影响，发现随电压升高，可待因和麻黄碱的峰高均降低，但出峰时间缩短，当电压为14kV时，两被测物出峰时间均<5min，为保证较快的测定速度，选择分离电压为14 kV。 2.5 样品溶剂的选择 在胶束扫集法中，样品溶液的组分、电导与缓冲液的差异可影响被测物的峰形及峰高，样品溶剂的组分、电导与缓冲液越相似，基线越平稳；而当溶剂电导与缓冲液相差较远时，形成电堆积的现象越明显，表现为峰增高。本试验考察了：水、18%乙腈、10 mmol/L NaH PO4-18%乙腈(pH2.20)、20 mmol/L NaHPO4 (pH 2.10)、20mmol/L NaH PO4 (pH 1.90)等5种不同溶剂溶解样品时的出峰情况，最终采用水为样品溶剂，此时可获得最佳峰形及峰高。 2.6 进样时间 实验了进样时间为10、20、30、40、50s(H=9.0 cm)时的出峰情况。随进样时间延长，峰增高，但峰变宽，柱效下降，当进样时间>30s时，实际样品测定时产生毛细管吸附现象，稳定性较差，因而选择进样时间为20s。 2.7 方法性能 在优化条件下，用系列标准溶液对方法的性能进行考察，结果见表1。可见，在一定的范围内 拟合曲线呈良好的线性关系，各被测物的检出限 ≤0.833 ug/mL。 表1 胶束扫集方法性能 Tab.1 Linear range，linear regression equation， reproducibility of peak area and LODs by sweeping 样品 线性范围 线性回归方程 1* 峰面积 检出限 /(ug/mL) RSD/%(n=5) /(ug/mL) 麻黄碱 1.73~27.7 y=44.5p+4.57 0.9997 1.2 0.433 可待因 3.33~50.3 y=15.8p+8.35 0.9996 2.8 0.833 2.8 重复性实验及柱间实验 在优化条件下，按照1.2方法进行日内、日间 及柱间实验，统计结果见表2.可见日内、日间、柱间的稳定性均较好。 表2 日内、日间及柱间相对标准偏差 Table.2 RSDs of intra-day， inter-day and inter column by standard 测量项 日内RSD/%(n=5) 日间RSD/%(n=5) 柱间 RSD/%(n=3) 麻黄碱 可待因 麻黄碱 可待因 麻黄碱 可待因 峰高 8.3 9.2 8.4 8.5 2.9 6.3 峰面积 3.5 4.2 8.0 6.8 0.5 2.3 出峰时间 2.9 2.9 3.8 3.9 3.5 4.2 2.9 样品分析及回收率 将磷酸可待因口服液，稀释50倍，在优化条件下平行测定5次，电泳图谱如图1所示。经计算，样品中被测物的含量及 RSD 分别为：盐酸麻黄碱0.38 mg/mL，3.7%；磷酸可待因0.89 mg/mL，4.1%。在优化条件下，进行回收率实验，结果见表3. t/min 图1 止咳露实际样品电泳图(a)及样品加标电泳图(b) Fig.1 Electropherograms of the real sample with (b) andwithout (a) standards 表3 止咳露中两种被测物的回收率 Tab.3 Recoveries for two analytes in Coughsyrup 成分 加入量/(ug/mL) 测得量/(ug/mL) 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 6 5.91 98.6 麻黄碱 10 10.27 102.7 101.6 4.3 14 14.49 103.5 10 10.07 100.7 可待因 14 13.53 96.7 100.0 4.1 18 18.49 102.7 ( 参考文献 ) ( ] 陈 义.毛细管电泳技术及其应用.北京：化学工业 出版，2000. 5 ) ( T21 孟品佳.中国人民公安大学学报(自然科学版) ， 2006，12(2)：1 ) ( [3 饶 毅，王义明，罗国安.分析科学学报，2001， 17(3)：182 ) ( [4] J Joselit P Quirino ， Jong-Bok Kim， S higeru T erabe. 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The buffer contained 60 mM SDS ， 10 mM NaH PO4(pH2.20)， and 18%ACN(V/V). The sepa-ration voltage was -14 kV， detected at 200 nm. Effect of pH， SDS concentration， and sample solvent was discussed.Under the optimum conditions， every determination was finished within 5 minutes.The LODs (ug/mL)， linearities(ug/mL) and Rs was 0.433，1.73~27.7， 0.9997 for Ep， and 0.833，3.33~50.3，0.9996 for Co， with recoveries between 96.7% and 103.5%. Peak area RSDs (%) of both Ep and Co were not more than 4.2， 8.0， 2.3 forintra-day (n=5)， inter-day (n=5)， inter- column (n=3) exprement respectively. Key words： Capillary electrophoresis； Sweeping； Ephedrine； Codeine hina Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net