温胃舒颗粒中乌头碱检测方案(毛细管电泳仪)

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·1577中草药 Chinese Tra ditional and Herbal Drugs 第40卷第10期2009年10月 高效毛细管电泳法测定温胃舒颗粒中乌头碱 李 ，蒋 晔*，，孙 婷 (河北医科大学药学院分析化学教研室，河北石家庄 050017) 摘 要：目的 建立毛细管电泳场放大富集技术快速检测温胃舒颗粒中痕量有效毒性成分乌头碱的方法。方法采用未涂层石英毛细管(43 cm X50 um，有效长度35 cm)为分离通道，60 mmol/L磷酸二氢钠(pH6.0)-乙腈(8：2)为运行缓冲溶液；运行电压10 kV；进样电压12kV，进样时间30s；在进样之前设定用水冲洗，压力为3.5 kPa，冲洗时间5s；紫外检测波长235nm。结果 乌头碱在37.5~2.4 ×10'ng/mL 线性关系良好(r=0.999 5)，最低检测限为11.3 ng/mL ，平均回收率大于97.3%。结论 本方法简便、快速、专属性强、富集效率高，为温胃舒颗粒在生产过程中的质量控制及临床药物监测提供可靠的分析手段。 关键词：温胃舒颗粒；乌头碱；毛细管电泳 中图分类号：R286.02 文献标识码：A 文章编号：0253-2670(2009)10-1577-03 温胃舒颗粒是由党参、附子(制)、黄芪(炙)和肉桂等10多味中药制成的中药制剂，具有扶正固本，温胃养胃，行气止痛，助阳暖中之功效，临床常用于治疗慢性萎缩性胃炎、慢性胃炎所引起的胃脘冷痛，腹胀，嗳气，纳差，畏寒，无力等症。方中附子具有回阳救逆，补火助阳，逐风寒湿邪等作用，其主要有效成分乌头碱的毒性很强，人口服0.2mg即可出现中毒症状，3~5 mg可致死。目前附子没有严格统一的炮制方法，导致因服用含乌头类中药及其制剂而中毒或死亡的现象屡有发生。因此，为控制药品质量，保证用药安全，有必要对温胃舒颗粒中痕量毒性成分乌头碱进行限量检测。对于乌头碱的检测主要采用分光光度法2]、薄层色谱法3.4]和高效液相色谱法5~71。分光光度法测定的是药材或制剂中总生物碱，选择性差，达不到对乌头碱限量控制的要求。薄层色谱法样品预处理繁琐费时，并且由于乌头碱的量较低，共存组分干扰较大而导致特异性差，误差大，定量分析不够准确。由于中药制剂成分复杂，高效液相色谱法对于结构相近的碱性物质的分离难度较大7，因此对样品的预处理及柱效要求较高。本实验建立毛细管电泳场放大富集技术快速检测温胃舒颗粒中的痕量有效毒性成分乌头碱。该方法将毛细管电泳分离度高、样品用量少、环境污染小等优点与场放大富集技术选择性好及适应痕量分析的要求相结合，大大提高了定量分析中的专属性和灵敏度，为温胃舒颗粒生产过程中的质量控制及防止药物中毒提供可靠方便实用的分析手段。 1 仪器与试药 高效毛细管电泳仪、高压电源、紫外检测器(北京彩陆科学仪器有限公司)；未涂层石英毛细管(43 cm ×50 {m，有效长度35 cm)(河北永年光导纤维厂)。 乌头碱对照品(批号110720-200410)由中国药品生物制品检定所提供；温胃舒颗粒由合肥神鹿双鹤药业有限责任公司生产。乙腈为色谱纯，磷酸二氢钠为分析纯，水为重蒸水。 2 方法与结果 2.1 电泳条件：运行缓冲溶液为60 mmol/L 磷酸二氢钠(pH6.0)-乙腈(8：2)；运行电压10kV；进样电压12kV，进样时间30s；在进样之前设定用水冲洗，压力为3.5kPa，冲洗时间5s；温度25℃；紫外检测波长235 nm。开机后毛细管柱用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液冲洗 10 min，水冲洗10 min，运行缓冲液冲洗10 min ，每次进样前用0.1 mol/L氢氧化钠溶液、水和运行缓冲液分别冲洗3 min。所有溶液在使用前均用0.45um纤维树脂膜滤过。在以上电泳条件下，乌头碱峰的保留时间约为4.0min，温胃舒颗粒中其他药材对乌头碱的测定不产生干扰，见图1。 2.2 供试品溶液的制备：取本品，研细，取粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加1 mol/L盐酸10 mL，冰浴超声处理40 min，滤过，取续滤液5mL，置分液漏斗中，用乙醚洗涤3次，每次10mL，弃去乙醚液，将酸水层用氨水调pH值为9~10，再用乙醚提取3次，每次10 mL，收集乙醚层，挥干，残 ( * 收 稿日期：2009-01-10 ) ( 作者简介：李 (1981→，女，河北唐山人，助教，硕士研究生，研究方向为药物的质量研究与质量控制。 ) ( Tel ：(0311)86266069 E mail ：lijunmei20082008@163.com ) ( *通讯作者 蒋 晔 T el：(0311)86266069 Email ：jiangye @hebmu. e du. cn ) 图1 乌头碱对照品(A)和温胃舒颗粒(B)的高效毛细管电泳色谱图 Fig 1 Capillary electrophoretograms of aconitine refer-ence substance (A) and Wen weishu Granula (B) 渣用20%的乙腈溶解，置10mL量瓶中，用20%的乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。 2.3 对照品溶液的制备：精密称取乌头碱对照品约24mg，置100 mL量瓶中，加20%乙腈使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。 2.4 线性关系考察：精密吸取乌头碱对照品溶液1mL置100mL量瓶中，加20%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为1号工作液。从1号工作液中吸取5mL置10mL量瓶中，加20%乙腈稀释至刻度，摇匀，得2号工作液，依此法对倍稀释得3、4、5、6、7号系列对照品溶液，质量浓度分别为2.4×10、1.2×10°、600300、150、7537.5 ng/mL。按以上电泳条件进样，记录色谱峰面积。以峰面积对质量浓度进行线性回归，得线性方程Y=47.2 X- 6.1，r=0.9995结果表明：乌头碱在37.5~2.4 ×10'ng/mL线性关系良好。 2.5 最低检出限测定：取乌头碱对照品溶液稀释，进样并记录电泳图，按 S/N=3计，结果乌头碱最低检测限为11.3 ng/mL。 2.6 精密度试验：取同一供试品溶液，连续进样分析5次，记录峰面积，结果乌头碱峰面积的RSD 为2.3%。 2.7 稳定性试验：取同一供试品溶液在相同电泳条件下分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，记录色谱峰面积，结果乌头碱峰面积的RSD 为2. 9%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。 2.8 重现性试验：取同一批(批号0704012)样品5份，制备供试品溶液，进样测定，记录色谱峰面积，结果乌头碱峰面积的RSD 为2.4%。 2.9 加样回收试验：精密称取批号0704012温胃舒颗粒粉末约1.00g，分别加入19.2、24.0、28.8ug乌头碱对照品，制备供试品溶液，进样测定，计算乌头碱加样回收率和 RSD，结果回收率分别为 97.3%97.8%、97.3%.RSD分别为1.4%、1.7%、1.3%(n=9). 2.10 样品的测定：取3批温胃舒颗粒样品，制备供试品溶液，按以上电泳条件进样，以标准曲线法计算乌头碱的质量分数，结果见表1。 表1 温胃舒颗粒中乌头碱的测定结果(n=3) Table 1 Determination of aconitine in Wen weishuGranula(n=3) 批号 乌头碱/(mgg ) 0704010 0.030 0704012 0. 024 0704013 0.024 3 讨论 3.1 电泳条件及富集条件的优选：分别考察了缓冲溶液的pH值、浓度、有机添加剂、预进溶液、进样时间和运行电压对峰形、保留时间和富集效果的影响，同时优化了电泳条件。 pH值对分离度和迁移时间具有显著影响。实验对pH4.0~8.0进行了考察，结果表明：随着pH值增加，电渗流增强，迁移时间继而缩短，而当pH值大于6.0时，迁移时间逐渐增加，故选择pH值为6.0. 离子强度(浓度)主要影响双电层厚度，离子强度越大双电层越薄，电渗降低；同时浓度越大电流越大，其产生的焦耳热也越大，基线噪声提高。故在缓冲溶液pH值为6.0的条件下，实验考察了磷酸二氢钠溶液在不同浓度(40、50、60、70、80 mmol/L)时对乌头碱保留情况及峰形的影响，结果表明磷酸二氢钠浓度为60 mmol/L时，乌头碱峰迁移时间最小，且与样品中其他药材分离良好，故选择缓冲溶液的浓度为 60 mmol/L。 有机添加剂主要影响组分的分离选择性和柱效，同时有机添加剂比例增加，迁移时间随之增加。实验考察了乙腈比例在10%~40%对乌头碱分离度及迁移行为的影响。结果表明：随着乙腈比例的增加，乌头碱的分离选择性增加，当乙腈比例为20%时，乌头碱与样品中其他组分达到良好分离。继续增加乙腈比例，分离度提高不明显而迁移时间显著增加，故选择乙腈比例为20%。 在样品电动进样之前注入一段低电导的溶液塞可以提高富集效果。这是因为施加电压后，低电导的溶液塞所在区带的电场很强，在电动进样时，被分析离子会快速迁移通过低电导的溶液塞，达到分离电解质的界面时因电场强度的显著降低而快速地降低迁移速率，从而使分析物离子在分离前得到有效 富集。实验分别考察了预进水和乙腈对富集效果的影响。结果表明：在实验电泳条件下，预进水和乙腈时，与常规电迁移进样相比，检测灵敏度分别提高400、250倍。故选择水为预进溶液。 进样时间的长短主要影响进样量的大小，从而影响富集效果。实验考察了进样时间在20~40s对富集效果的影响。结果表明：随着进样时间的增加，峰高明显增加，在30s之前无减缓趋势，继续增加进样时间，峰高不再增加，峰展宽明显，柱效降低，而不利于定量测定，故选择进样时间为30s。 实验考察了在60 mmol/L磷酸二氢钠(pH6.0)-乙腈(8：：2)缓冲体系下，不同进样电压(8、10、12、14、16kV)对富集效果的影响。结果表明：峰高随进样电压的增加而增高，但是随着进样电压的增大，组分保留时间减小，而乌头碱峰与样品中其他组分峰分离度减小，不利于分离测定。当进样电压为12kV时，乌头碱峰峰形良好，各组分均完全分开，故选择最佳进样电压为12kV。 3.2 提取条件的选择：乌头碱的提取常采用冷浸法和超声提取法决，但提取的效果不尽相同。由于乌头碱为亲脂性生物碱，并且对热很不稳定8]，因此实验利用生物碱的碱性，加酸冰浴超声提取40min 使生成盐溶于水，加乙醚萃取去除脂溶性杂质，再碱化，用乙醚萃取，去除水溶性杂质。该法效果良 好，使待测组分处无干扰。同时采用冰浴超声提取既防止成分遇热分解又大大提高了提取效率。 本实验建立了毛细管电泳场放大富集技术快速检测温胃舒颗粒中痕量有效毒性成分乌头碱的方法。该方法样品预处理简单、分离效率高、分析速度快、灵敏度高、线性范围宽、实验成本低、环境污染小。检测灵敏度与常规进样相比提高400倍，达到了文献报道的高效液相色谱法的水平且有较高的分离选择性。 ( 参考文献： ) ( [1] 符华林.1 我国乌头属药用植物的研究概况[J].中药材，2004， 27(2)：149-152. ) ( [2] 姚志凌，李明辉.分光光度法测定风湿定胶囊中乌头碱含量 [J].中国药业，2007，16(5)：22-23. ) ( [3] 李焕荣，张荣华，崔健，等.薄层扫描法测定镇痛宁注射液 中乌头碱的含量[J].中草药，1996，27(1)：58-59. ) ( [4] 张晓宏，周 莉，杨龙辉，等.血宝胶囊的薄层色谱鉴别及乌 头碱的限量控制[J].华西药学杂志，2001，16(6)：451-454. ) ( [5] 刘 刚，王 E 辉，周本宏.高效液相色谱法测定思康达胶囊 中乌头碱的含量[J].医药导报，2005，24(12)：1170-1171. ) ( [6] Wang Z H， WenJ， X in g J B， et al. 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HPLC测定肺康膏中次乌头碱的含 量[J].中成药，1999，21(12)：626-628. ) HPLC法测定小半夏汤中6-姜酚和6-姜醇 张科卫，吴 皓，，崔小兵 (南京中医药大学，江苏南京 210029) 摘 要：目的 研究以 HPLC法同时测定小半夏汤中6-姜酚、6-姜醇的方法。方法 采用 Kromasil Ci8柱(250 mm ×4.6mm，5 um)；流动相：甲醇-水(65：35)；检测波长：280 nm；柱温：30℃；体积流量：0.8 mL/min。结果 6-姜酚在1.273~11.457 ug 与峰面积呈现良好的线性关系，r=0.999 9；6-姜醇在0.444~3.996pg 与峰面积呈现良好的线性关系，r=0.999 8。平均加样回收率(n=5)：6-姜酚为99.82%；6姜醇为100.30%。结论 本法操作简便，结果可靠，重现性好，可作为小半夏汤质量控制的方法。 关键词：小半夏汤；6-姜酚；6姜醇；高效液相色谱 中图分类号：R286.02 文献标识码：A 文章编号：0253-2670(2009)10-1579-03 小半夏汤出自张仲景的《金匮要略》，虽然仅由半夏、生姜两味药组成，却有着很好的止呕效果，所 以历代医家对其倍加推崇，称其为“呕家圣剂”。目前对其的研究主要集中在药理药效方面。本课题 ( * 收 稿日期：2008-12-10 ) ( 基金项目：南京中医药大学青年科技创新基金项目(05XZR08) ) ( 作者简介：张科卫(1971→，女，博士研究生，助理研究员，主要从事中药复方与炮制研究。 ) ( Tel：(025)86798269 E mail： kewei _ 3 1 @163. com ) ( *通讯作者 吴皓 ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net